發(fā)布時(shí)間：2020-05-14 08:45

【摘要】：第一部分毒理學(xué)研究1慈濟(jì)化癌保生Ⅱ號(hào)方吸收成分研究目的:慈濟(jì)化癌保生Ⅱ號(hào)方(Ciji Hua'ai Baosheng Ⅱ Formula,簡(jiǎn)稱(chēng)CHB-Ⅱ-F),由茯、黨參、牡蠣、酸棗仁、陳皮、炒麥芽、丹參、平貝母8味藥組成,臨床應(yīng)用多年,療效較好,但作用的物質(zhì)基礎(chǔ)不明。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究CHB-Ⅱ-F的吸收生物活性成分,有助于闡明復(fù)方發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。方法:(1)將以上8味飲片混合煎煮,濃縮并制成凍干粉備用。精密稱(chēng)取復(fù)方水煎液凍干粉末,超聲溶解。運(yùn)用超高效液相色譜法(UHPLC)和高分辨率電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)器(HR-ESⅠ-MS)分析CHB-Ⅱ-F水煎液以及血清吸收生物活性成分。(2)SPF級(jí)昆明小鼠20只,將2×107/mL肝癌H22細(xì)胞懸液接種于小鼠右前腋皮下,一周后成功長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)腫瘤后,一次性大劑量200 mg/kg(0.2 mL/10g)腹腔注射5-氟脲嘧啶,建立H22肝癌小鼠皮下移植瘤化療后模型。隨機(jī)分為2組:空白組、給藥組(CHB-Ⅱ-F)。次日開(kāi)始給藥,空白組以蒸餾水0.2 mL/10g進(jìn)行灌胃;給藥組以1.625 g/mL(32.5g/kg)灌胃中藥CHB-Ⅱ-F,1次/日,連續(xù)7天。第7天灌胃給藥1h后,摘眼球,取外周血,分離血清。結(jié)果:(1)超高效液質(zhì)譜聯(lián)用法能檢測(cè)出CHB-Ⅱ-F水煎液含有10種組分:原兒茶醛、咖啡酸、斯皮諾素、黃芩苷、丹酚酸C、橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸、川陳皮素。(2)超高效液質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)出CHB-Ⅱ-F含藥血清中有4種組分:β-谷甾醇、丹酚酸B、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚。結(jié)論:CHB-Ⅱ-F水煎液及含藥血清中均含吸收生物活性成分,其臨床應(yīng)用的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與所檢測(cè)出的活性成分有關(guān)。2慈濟(jì)化癌保生Ⅱ號(hào)方急、慢性毒理學(xué)研究目的:按照中藥藥效毒性試驗(yàn)研究要求,評(píng)價(jià)CHB-Ⅱ-F在正常小鼠和大鼠服用后有無(wú)急、慢性毒性反應(yīng)。方法:急性毒性試驗(yàn)中,每只小鼠按117g/kg(3.9g/mL)灌胃,24h灌胃3次,連續(xù)灌胃14天,并記錄小鼠的一般情況,不良反應(yīng)及死亡率。慢性毒性試驗(yàn)中,大鼠分別按97.5 g/kg、48.75 g/kg、24.375 g/kg(分別相當(dāng)于人臨床劑量的30倍、15倍、7.5倍)灌胃CHB-Ⅱ-F,連續(xù)4周。觀察CHB-Ⅱ-F灌胃4周及停藥恢復(fù)期2周后的大鼠慢性毒性反應(yīng)及停藥后可能出現(xiàn)的毒性可逆反應(yīng)。每日詳細(xì)記錄大鼠的一般情況及死亡數(shù)量,每周記錄一次體重及攝食量。連續(xù)灌胃給藥4周和停藥恢復(fù)期2周時(shí)分別檢測(cè)大鼠的血液學(xué)指標(biāo)、生化指標(biāo)、臟器重量、大小便常規(guī)以及主要臟器組織病理變化。結(jié)果:急性毒性試驗(yàn)中CHB-Ⅱ-F按117g/kg(3.9g/mL)每次灌胃小鼠,未觀察到不良反應(yīng)及小鼠死亡,測(cè)定該方對(duì)小鼠最大耐受量大于351 g/kg,相當(dāng)于臨床劑量的108倍。慢性毒性試驗(yàn)中,連續(xù)灌胃4周結(jié)束后,按97.5g/kg灌胃的雄性大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)總膽固醇(TCHO)增加,心臟和脾臟指數(shù)相對(duì)升高;雌性大鼠體重增加;血液學(xué)檢查中紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)增加;按48.75 g/kg灌胃的雄性大鼠血液生化指標(biāo)中的甘油三酯(TG)增加;按24.375 g/kg灌胃的雄性大鼠肝臟系數(shù)升高;脾臟指數(shù)升高。連續(xù)灌胃4周后其余檢測(cè)項(xiàng)目以及恢復(fù)期2周后所有血液常規(guī)、血液生化、大小便常規(guī)、攝食量及主要組織病理染色均未見(jiàn)異常。結(jié)論:CHB-Ⅱ-F的小鼠最大耐受劑量大于351g/kg。大鼠大劑量服用CHB-Ⅱ-F連續(xù)服用4周,無(wú)明顯臟器病理?yè)p傷;停藥2周后未觀察到明顯不良反應(yīng)。因此,CHB-Ⅱ-F每日劑量少于351 g/kg或者連續(xù)4周每日服用劑量為24.375 g/kg均被認(rèn)為是安全的。第二部分作用及機(jī)理研究3研究慈濟(jì)化癌保生Ⅱ號(hào)方對(duì)腫瘤小鼠化療后癌凋亡作用及機(jī)制目的:CHB-Ⅱ-F是傳統(tǒng)中藥復(fù)方,長(zhǎng)期應(yīng)用臨床可減輕腫瘤患者化療后的不適癥狀,提高生存質(zhì)量,延長(zhǎng)生存周期,但其作用機(jī)理尚未完全闡明。本研究從促凋亡角度探討CHB-Ⅱ-F對(duì)H22肝癌移植瘤化療后小鼠腫瘤細(xì)胞的相關(guān)作用及機(jī)理。方法:SPF級(jí)昆明小鼠72只,將H22肝癌細(xì)胞懸液(2X107/mL)等體積接種于小鼠右前腋皮下,一周后成功長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)腫瘤后,大劑量5-氟脲嘧啶按200 mg/kg(0.2 mL/10g)一次性腹腔注射,建立H22肝癌小鼠皮下移植瘤化療后模型。隨機(jī)分為6組:模型組、西藥對(duì)照(5-FU)(20 mg/kg)組、中藥對(duì)照組(養(yǎng)正消積膠囊)(0.78 g/kg)及CHB-Ⅱ-F低(16.25 g/kg)、中(32.5 g/kg)、高(65 g/kg)組。造模次日開(kāi)始給藥,14天后剝離腫瘤,稱(chēng)重,計(jì)算腫瘤指數(shù),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)瘤細(xì)胞周期和凋亡率,分別運(yùn)用HE染色光鏡觀察瘤組織病理改變和透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變,運(yùn)用蛋白印跡法測(cè)定小鼠腫瘤組織中活化的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果:CHB-Ⅱ-F三個(gè)劑量組前后體重增加與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)意義。與模型組比較,CHB-Ⅱ-F給藥組第7天時(shí),腫瘤體積明顯較小;第14天時(shí),CHB-Ⅱ-F高劑量組腫瘤體積大小明顯減小且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用藥各組分別與模型組比較,不同程度減輕腫瘤組織的病理改變,超微電鏡觀察均出現(xiàn)不同程度的凋亡。CHB-Ⅱ-F中、高劑量組腫瘤細(xì)胞在G0-G1期和S期所占百分比與模型組比較差異顯著,CHB-Ⅱ-F高、中劑量組的瘤細(xì)胞凋亡率均高于模型組。經(jīng)蛋白印跡檢測(cè),CHB-Ⅱ-F低、中、高劑量組活化Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加,CHB-Ⅱ-F中、高劑量組與中藥對(duì)照組活化Caspase-8表達(dá)顯著增加;CHB-Ⅱ-F低、中劑量組在Caspase-9蛋白表達(dá)顯著增加,CHB-Ⅱ-F中劑量組活化Caspase-9表達(dá)較模型組增加。CHB-Ⅱ-F低、中組的促凋亡蛋白Bax表達(dá)明顯增加;表明CHB-Ⅱ-F低、中劑量組可以引起B(yǎng)ax/Bcl-2的比值增加。結(jié)論:CHB-Ⅱ-F可改善H22肝癌移植瘤化療后小鼠的毛發(fā)、飲食等一般情況;可減緩小鼠移植瘤生長(zhǎng)速度;不同程度減輕腫瘤組織的病理改變,減少腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)瘤細(xì)胞凋亡;輔助化療的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腫瘤凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

１．４．１慈濟(jì)化癌保生ＩＩ號(hào)方的ＵＨＰＬＣ－ＭＳ成分分析逡逑將慈濟(jì)化癌保生ＩＩ號(hào)方水煎液采用ＵＨＰＬＣ－ＭＳ檢測(cè)分析得到該復(fù)方的總離逡逑子流圖，見(jiàn)圖１。分析慈濟(jì)化癌保生ＩＩ號(hào)方的總離子流圖譜及相對(duì)一級(jí)圖譜，，方劑逡逑中有１０種成分被檢測(cè)出來(lái)：原兒茶醛、咖啡酸、斯皮諾素、黃芩苷、丹酚酸Ｃ、逡逑２３逡逑

圖２空白血清（Ａ）、ＣＨＢ－ＩＩ－Ｆ含藥血清（Ｂ）質(zhì)譜圖及所含活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)式（Ｃ）逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｂｌａｎｋ邋ｓｅｒｕｍ邋ｉｏｎ邋ｍａｐ邋（Ａ），邋ｄｒｕｇ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋ｓｅｒｕｍ邋ｉｏｎ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ＣＨＢ－ＩＩ－Ｆ邋（Ｂ）邋ａｎｄ逡逑ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｗｏ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ邋ａｃｔｉｖｅ邋ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ邋（Ｃ）逡逑注：Ｂ圖中１）丹酚酸Ｂ；邋２）邋ｐ－谷甾醇３）補(bǔ)骨脂乙素４）補(bǔ)骨脂酚逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｂ：邋１）邋Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ邋ａｃｉｄ；邋２）邋ｐ－Ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ；邋３）邋Ｉｓｏｂａｖａｃｈａｌｃｏｎｅ；邋４）邋Ｂａｋｕｃｈｉｏｌ逡逑１．４．２肝癌Ｈ２２荷瘤小鼠含藥血清的ＵＨＰＬＣ－ＭＳ成分分析逡逑采用ＵＨＰＬＣ－ＭＳ分別分析肝癌移植瘤小鼠化療后服用慈濟(jì)化癌保生ＩＩ號(hào)方逡逑后含藥血清與化療小鼠灌胃蒸餾水的空白血清。對(duì)比分析兩者血清離子圖譜，其逡逑中有４種活性成分被檢測(cè)出來(lái)：丹酚酸Ｂ、卩－谷甾醇、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂酚。保逡逑留時(shí)間分別為９．６２邋ｍｉｎ、９．７９邋ｍｉｎ、１１．２７邋ｍｉｎ、４３．９５邋ｍｉｎ。逡逑１．５討論逡逑
【學(xué)位授予單位】：廈門(mén)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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