發(fā)布時間：2020-05-14 07:57

【摘要】：[目的]本實驗通過體外培養(yǎng)胰島β細胞INS-1糖脂毒模型,用“益氣養(yǎng)陰清熱”糖耐康進行分組干預(yù),觀察糖耐康對糖脂毒下的胰島β細胞活力、凋亡以及胰島素分泌的影響,并進一步從胰島β細胞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路探討糖耐康對PI3K/Akt下游FOXO1等因子的影響,探索其具體作用靶點。為中藥治療糖脂毒誘導(dǎo)的早期2型糖尿病提供理論依據(jù)。[方法]1.糖耐康含藥血清對糖脂毒損傷的INS-1細胞活力的影響體外選用大鼠胰島素瘤細胞系INS-1細胞為本實驗研究對象,以33.3mM葡萄糖刺激培養(yǎng)INS-1細胞構(gòu)建糖毒性模型,以0.5mM棕櫚酸刺激培養(yǎng)INS-1細胞構(gòu)建脂毒性模型,33.3mM葡萄糖聯(lián)合0.5 mM棕櫚酸刺激培養(yǎng)INS-1細胞構(gòu)建糖脂毒性模型。制備糖耐康含藥血清,分糖耐康低(5%)、中(8%)、高(10%)劑量進行干預(yù),以鹽酸二甲雙胍作為西藥對照,以高糖、棕櫚酸、高糖聯(lián)合棕櫚酸分別作為模型對照。CCK-8檢測各組INS-1細胞活力、流式細胞熒光染色以及caspase-3活性觀察細胞凋亡、ELISA測葡萄糖刺激下INS-1細胞的胰島素分泌功能。2.糖耐康含藥血清對糖脂毒損傷的INS-1細胞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響糖脂毒造模方法同上。制備糖耐康含藥血清,分糖耐康低(5%)、中(8%)、高(10%)劑量進行干預(yù),以鹽酸二甲雙胍作為西藥對照,以高糖、棕櫚酸、高糖聯(lián)合棕櫚酸分別作為模型對照。采用免疫印跡法測定胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中胰島素受體底物-2(IRS2)及PI3K下游相關(guān)蛋白:叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FOXO1),蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的蛋白質(zhì)含量,以及IRS2(ser731)、FOX01(ser256)、P70s6k(htr389)的磷酸化水平。[結(jié)果]1.糖耐康含藥血清對糖脂毒損傷的INS-1細胞活力的影響高糖、高脂、高糖聯(lián)合高脂均能夠顯著降低INS-1細胞活力。經(jīng)中藥糖耐康干預(yù)后,與模型組相比,高劑量糖耐康組的細胞活力明顯上升、caspase-3活性明顯被抑制、胰島素分泌功能BIS、GSIS數(shù)值明顯上升。低劑量及中劑量糖耐康對上述指標(biāo)均有不同程度改善。與二甲雙胍對照組相比,高劑量糖耐康與二甲雙胍無統(tǒng)計學(xué)意義。2.糖耐康含藥血清對糖脂毒損傷的INS-1細胞胰島素信號轉(zhuǎn)到通路的影響高糖、高脂、高糖聯(lián)合高脂組IRS2蛋白表達降低,磷酸化水平升高。FOX01(ser256)、P70s6k(htr389)的磷酸化水平降低,PTP1B蛋白表達升高。經(jīng)中藥糖耐康干預(yù)后,與模型組相比,高劑量糖耐康組的細胞IRS2蛋白表達升高,磷酸化水平降低。FOXO1(ser256)、P70s6k(htr389)的磷酸化水平升高,PTP1B蛋白表達降低。與二甲雙胍對照組相比,高劑量糖耐康與二甲雙胍無統(tǒng)計學(xué)意義。[結(jié)論]1.糖耐康能夠改善糖脂毒刺激下的INS-1的細胞活力,抑制凋亡,改善胰島素分泌功能。2.糖耐康能夠調(diào)控糖脂毒刺激下的INS-1的細胞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的IRS2、PTP1B、FOX01因子,升高P70s6k(htr389)磷酸化水平,改善胰島細胞功能,進而調(diào)節(jié)糖脂代謝。
【圖文】：

增強錯誤蛋白的降解等，如果此種不良刺激不停止，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在，細胞開逡逑始凋亡�；罨D(zhuǎn)錄因子６（ＡＴＦ邋－６）、蛋白激酶Ｋ樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（ＰＥＲＫ）、肌醇依賴酶－１邋（ＩＲＩＭ）逡逑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白，構(gòu)成了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的三條通路。如圖１：逡逑

細胞活力下降至５１．邋９０％士４．８９％邋（ｐ＜０．邋００１），７２ｈ時，細胞活力下降至３９．邋７２％逡逑±４．邋０９％邋（ｐ＜０．邋００１）。３３．邋３ｍｍｏｌ／Ｌ的高糖培養(yǎng)液減弱了邋ＩＮＳ－１細胞活力，且和刺激時間逡逑呈正相關(guān)（見圖１－１）。臨床上早期糖尿病患者會有高胰島素血癥現(xiàn)象，短期高血糖刺激，逡逑胰島細胞會增加胰島素的產(chǎn)生，長時間刺激胰島素分泌則會持續(xù)下降。本實驗的幾個時逡逑間節(jié)點未發(fā)現(xiàn)胰島細胞活力增加的表現(xiàn)，原因可能有二：一是應(yīng)選取更短的時間節(jié)點觀逡逑察，如４ｈ或者６ｈ；二是臨床高胰島素血癥并不能說明胰島細胞活力增強。逡逑１２０．００％逡逑１００．００％邋＾逡逑ｒｅ邋６０．００％邋－逡逑ｕ邋４０．００％邋－邐＾逡逑２０．００％邋－逡逑０．００％邋＼邐！邐１邐，邐，逡逑Ｏｈ邐１２ｈ邐２４ｈ邐４８ｈ邐７２ｈ逡逑圖１－１高糖對ＩＮＳ－１細胞活力的影響（林＊邋ｐ＜０．邋００１）逡逑２．邋１．邋１．邋２高脂對ＩＮＳ－１細胞活力的影響逡逑經(jīng)過０．５ｍｍｏｌ／Ｌ棕櫚酸不同時間的培養(yǎng)后，，與正常組相比，ＩＮＳ－１細胞１２ｈT，其逡逑活力下降至邋８１．４５％士５．５２％邋（ｐ＜０．００１），邋２４ｈ邋時，其活力下降至邋７０．邋０６％±３．１０％邋（ｐ＜逡逑０．００１）
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2663058