【摘要】：背景:線粒體功能障礙是非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的重要發(fā)病機(jī)制。從天然產(chǎn)物中開發(fā)線粒體調(diào)節(jié)劑/營養(yǎng)素以治療線粒體功能障礙是防治NAFLD的有效策略。黃精(Polygonatum kingianum,PK)為重要藥食兩用資源,本課題組前期研究表明,滇黃精活性成分群(總多糖、總皂苷)可緩解2型糖尿病,其水提取也可以調(diào)節(jié)脂代謝異常。然而,滇黃精是否可緩解NAFLD及相關(guān)藥理機(jī)制仍不清楚。目的:從線粒體功能調(diào)節(jié)角度,采用細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究滇黃精對NAFLD的緩解作用及機(jī)制。方法:細(xì)胞實(shí)驗(yàn):20只SD雄性大鼠,隨機(jī)分為正常對照組(生理鹽水)、含藥肝線粒體組(滇黃精水提物,4 g/kg),連續(xù)灌胃給藥6周,每天1次,正常對照組大鼠喂基礎(chǔ)飼料,含藥肝線粒體組大鼠喂基礎(chǔ)飼料。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束取新鮮肝臟,勻漿后用差速離心法制得肝線粒體,經(jīng)甲醇沉淀后獲得正常肝線粒體樣品和滇黃精含藥肝線粒體樣品。將肝L-02細(xì)胞接種至6孔板中,分為正常組、模型組、給藥組(線粒體樣品),除正常組外其余各組用5%醫(yī)用脂肪乳造模液誘導(dǎo)肝L-02細(xì)胞24h后,將線粒體樣品(正常線粒體組50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL,滇黃精含藥線粒體組50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)給予醫(yī)用脂肪乳誘導(dǎo)的肝L-02細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h,顯微鏡下觀察細(xì)胞中脂滴,并用試劑盒檢測細(xì)胞中甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):63只SD雄性大鼠,隨機(jī)分為正常對照組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、白藜蘆醇組(陽性對照,40 mg/kg)、生滇黃精水提物低、中、高劑量組(1、2、4 g/kg)、制滇黃精水提物低、中、高劑量組(1、2、4 g/kg),連續(xù)灌胃給藥14周,每天1次,除正常對照組外其余各組大鼠喂高脂飼料14周誘發(fā)NAFLD。于14周眼角取血,試劑盒檢測血清TG、TC、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平;處死大鼠后,測定臟器(肝、脾、腎)指數(shù),試劑盒檢測肝臟中TC、TG、HDL-C水平,檢測肝臟線粒體中MDA、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、ATP合酶及呼吸鏈復(fù)合物I、II水平;qPCR檢測大鼠肝臟中UCP-2和CPT-1mRNA表達(dá)量;Western blot檢測大鼠肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Caspase-3、Caspase-9、Cytchrome c、Bcl-2、Bax)表達(dá)量。結(jié)果:細(xì)胞實(shí)驗(yàn):除正常組外,其余各組在醫(yī)用脂肪乳誘導(dǎo)肝L-02細(xì)胞24 h后,均產(chǎn)生脂滴,給予滇黃精含藥線粒體后,滇黃精含藥肝線粒體組細(xì)胞中脂滴明顯減少,且TC、TG、MDA水平顯著降低(P0.01,P0.001),同時(shí)SOD活力顯著升高(P0.001)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):高脂飼料喂養(yǎng)大鼠被成功誘發(fā)NAFLD,分別給予生、制滇黃精水提物后,發(fā)現(xiàn)大鼠肝指數(shù)顯著降低,肝細(xì)胞腫脹、變性、壞死及炎性損傷減輕,肝臟TC、TG顯著降低(P0.05,P0.01,P0.001)及HDL-C顯著升高(P0.01),血清TC,TG,ALT,AST,LDL-C降低(P0.05,P0.01,P0.001)及HDL-C顯著升高(P0.05),肝線粒體中MDA含量顯著降低(P0.05)及SOD、GSH-PX、ATP合酶與呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ活性顯著升高(P0.05,P0.01,P0.001),肝臟中UCP-2 mRNA顯著下調(diào)及CPT-1 mRNA顯著上調(diào),肝臟中Caspase-3、Caspase-9、Bax表達(dá)量顯著降低(P0.05,P0.01,P0.001),肝臟中Bcl-2與肝線粒體中Cytchrome c表達(dá)量顯著升高(P0.05,P0.01,P0.001)。生、制滇黃精同劑量組間比較發(fā)現(xiàn),制滇黃精血清ALT、AST、LDL-C水平顯著低于生滇黃精(P0.05),制滇黃精肝臟TC水平顯著低于生滇黃精(P0.05),制滇黃肝臟HDL-C水平顯著高于生滇黃精(P0.01),生滇黃精MDA含量顯著低于制滇黃精(P0.05,P0.01),生滇黃精SOD、GSH-PX水平高于制滇黃精P0.05,P0.01),制滇黃精Na~+-K~+-ATP酶、ComplexⅡ活力顯著高于生滇黃精(P0.01,P0.001,P0.001),制滇黃精Caspase-9表達(dá)量顯著低于生黃精(P0.05),制滇黃精Cytchrome c、Bcl-2表達(dá)量顯著高于生滇黃精(P0.05,P0.001),生滇黃精Caspase-3、Bax表達(dá)量顯著低于制滇黃精(P0.001)。結(jié)論:滇黃精含藥肝線粒體可緩解醫(yī)用脂肪乳誘導(dǎo)的肝L-02細(xì)胞脂肪變性,生、制滇黃精均能通過改善線粒體功能而緩解高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD,其機(jī)制可能與增強(qiáng)線粒體的抗氧化應(yīng)激,能量代謝、脂肪酸β-氧化以及抑制肝細(xì)胞凋亡有關(guān),滇黃精可用于防治NAFLD的線粒體調(diào)節(jié)劑(營養(yǎng)素)的開發(fā)。制滇黃精在降低血清與肝臟脂質(zhì),提高線粒體能量代謝及抑制線粒體介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡方面效果優(yōu)于生滇黃精,而生滇黃精抗氧化應(yīng)激效果優(yōu)于制滇黃精,結(jié)果為滇黃精的臨床應(yīng)用及資源深入開發(fā)利用提供重要科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

結(jié)果精含藥肝線粒體對脂肪變性肝 L-02 細(xì)胞，正常組細(xì)胞正常生長（圖 1-1A），其余各組給予醫(yī)圖 1-1B～I(xiàn)），表明造模成功。給藥 24 h 后，陽性藥非粒體組低、中、高劑量組細(xì)胞脂滴數(shù)量較模型組一定程好，邊緣規(guī)則清晰（圖 1-2C、G、H、I），但正常線粒型組相比脂滴數(shù)目減少不明顯（圖 1-2D、E、F）。結(jié)體可明顯減少醫(yī)用脂肪乳誘導(dǎo)的肝 L-02 細(xì)胞中脂滴。A BC

圖 1-2 給予含藥線粒體 24 h 后的肝 L-02 細(xì)胞A，正常組；B，模型組；C，非諾貝特組；線粒體低劑量組；E，正常線粒體中劑量組；F，正常線粒體線粒體低劑量組；H，含藥線粒體中劑量組；I，含藥線粒體精含藥肝線粒體對脂肪變性肝 L-02 細(xì)胞 所示，，與正常組相比，模型組 TG 含量顯著升高（P < 但無顯著性，表明醫(yī)用脂肪乳誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)異常。與黃精含藥肝線粒體低、中、高劑量組肝細(xì)胞中 TG 含量P < 0.01，P < 0.05），而正常肝線粒體各劑量組肝細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：云南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2662173