【摘要】：大黃(Rhei Radix et Rhizoma)是一味常用中藥,是蓼科植物唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.、藥用大黃Rheum offcinale Baill.以及掌葉大黃Rheum palmatum L.的干燥根莖及根,具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)及利濕退黃等作用,臨床用于實熱積滯便秘,血熱吐衄,目赤咽腫,癰腫疔瘡,腸癰腹痛,瘀血經(jīng)閉,產(chǎn)后瘀阻,跌打損傷,濕熱痢疾,黃疸尿赤,淋證,水腫,外治燒燙傷[1]。大黃主要成分為蒽醌類,包括大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚等,除此之外還有苯丁酮苷類、鞣質(zhì)、揮發(fā)油、多糖、脂肪酸、蛋白質(zhì)等[2]成分。大黃性味苦寒,瀉下之力迅猛,若使用不當,可能造成不良反應[3]。以往關于大黃及其主要成分蒽醌類的毒性研究已有報告,結(jié)論有一定差異,在多認為蒽醌類在一定劑量下可能造成肝腎毒性。但是以往對大黃及蒽醌的肝腎毒性機制研究較少。本研究擬在重復大黃及其總蒽醌的毒理學研究的基礎上,重點通過大黃對肝臟與腎臟轉(zhuǎn)運子表達的影響,初步探討其毒性機制。根據(jù)以往研究,大黃提取物的毒性劑量范圍在10～12 g/kg,大黃總蒽醌的毒性劑量范圍在135 mg/kg～4500mg/kg。本研究第一部分將參考此毒性劑量范圍設計實驗劑量,重復大黃提取物及總蒽醌的肝腎毒性研究。肝臟和腎臟分別是人體的代謝及排泄器官,在體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)以及外源性物質(zhì)包括藥物的代謝和轉(zhuǎn)運過程中起著非常重要的作用。本研究第二部分將主要觀察大黃及其總蒽醌對肝腎相關轉(zhuǎn)運子表達的影響,以初步探討其肝腎毒性機制。目的:觀察不同劑量下大黃提取物及總蒽醌的肝腎毒性,了解毒性劑量范圍;通過對肝腎相關轉(zhuǎn)運子mRNA的分析,探討大黃提取物及總蒽醌肝腎毒性機制。方法:健康SPF級SD大鼠80只,雌雄各半。按體重隨機分為對照組A、大黃提取物不同劑量組(2、8、16 g生藥/kg,分別相當于臨床劑量的1.25、5、10倍);對照組B、大黃總蒽醌不同劑量組(0.5、2.5、5 g藥粉/kg)。每組10只動物,雌雄各5只。大黃提取物不同劑量組均采用灌胃給藥,每日一次,連續(xù)給藥1個月。對照組A與大黃不同劑量組平行進行試驗,給予等體積的純凈水。大黃總蒽醌不同劑量組灌胃給藥10天,每日一次,連續(xù)給藥10天。對照組B與大黃總蒽醌平行進行試驗,給予等體積的純凈水。末次給藥結(jié)束后,采用代謝籠收集16h尿液,測量尿量,采用尿液分析儀進行尿定性指標檢測(尿蛋白、尿糖、尿膽原、紅細胞、白細胞等);采用ELISA方法測定尿液NGAL(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin)、KIM-1(Kidney injure molecule-1)含量。將動物麻醉后經(jīng)腹主動脈取血,分離血清,分析ALT、AST、BUN、CRE等血清生化指標及血象指標。摘取肝臟和腎臟,將部分肝、腎組織常規(guī)用甲醛固定、取材、脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色,顯微鏡下進行病理檢查。另外部分的腎臟組織分裝入去RNA酶的試管中,放入液氮速凍后放入-80℃C留存,用于后續(xù)RT-PCR試驗,分析腎臟的腎臟有機陰離子轉(zhuǎn)運體(OAT1、OAT3)、中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)、叢集素(Clusterin)mRNA表達水平。另取動物分成對照組和大黃總蒽醌5 g/kg劑量組,進行對氨基馬尿酸(PAH)清除率檢測實驗。大鼠灌胃給予大黃總蒽醌5 g/kg 10天后,腹腔注射10%水合氯醛麻醉(350 mg/kg大鼠)。在無菌條件下行頸總靜脈插管和股靜脈插管術(shù)。將手術(shù)成功的大鼠放入IVC籠具單籠飼養(yǎng),術(shù)后恢復。禁食12-16h(自由飲水)后,從頸靜脈推注濃度為6 g/L PAH溶液30 mg/kg后,靜脈滴注濃度為3 g/L PAH溶液6mg/h/100g45min,然后開始計時,在大鼠清醒狀態(tài)下,分別在1,5,10,15,20,25,30,40,50,60 min時間點采集血液樣品。每個時間點采血后,均靜脈輸入同體積的生理鹽水。在20,40,60 min收集大鼠尿液,并測量各時間段的尿液體積。采用HPLC分別分析血液和尿液中的PAH含量,計算PAH清除率。結(jié)果:1.大黃提取物和大黃總蒽醌劑量過高時可導致腎臟輕度損傷,但中、低劑量時無明顯肝腎毒性大鼠灌胃給予大黃提取物高劑量組(16 g生藥/kg,相當于臨床劑量的10倍)于給藥后出現(xiàn)軟便、被毛不干凈、無光澤、尿液顏色加深等現(xiàn)象;血清肌酐(CRE)水平較對照組升高(p0.001);雄性大鼠的腎臟重量顯著性降低(p0.05)。高劑量組其他生化指標和低、中劑量組生化指標未見有明顯毒理學意義的變化。病理檢查可見,高劑量組(16 g生藥/kg)肝臟出現(xiàn)輕微小灶狀炎癥細胞浸潤,但與對照組比較差異不明顯,故不認為有毒理學意義。高劑量組雌、雄大鼠的腎臟可見輕度或中度腎小管細胞腫脹、變性,少量炎癥細胞浸潤,其中雄性大鼠的腎臟病變較雌性大鼠稍重,有2只雄性大鼠可見片狀炎癥細胞浸潤伴有成纖維細胞增生。中、低劑量組未見肝、腎病理損傷。大黃總蒽醌高劑量組(5 g/kg)給藥后,大鼠體重明顯下降,可能與飼料攝入減少有關。給藥后大便稀軟,被毛不干凈,聳毛,無光澤。高劑量組給藥后第4天可見大鼠行動遲緩,精神萎靡厭動;第7天雄性大鼠死亡一只。故于給藥后第10天將各劑量組動物處死檢查分析。高劑量組(5 g/kg)的血液肌酐增高(p0.01),與對照組相比升高162.5%。與對照組相比,高劑量組腎臟重量及腎臟指數(shù)顯著性降低(p0.001)。病理形態(tài)學檢查結(jié)果顯示。高劑量組肝臟可見少數(shù)肝細胞嗜酸性增強,核濃染,但對照組也可見此現(xiàn)象,故毒理學意義不明顯。高劑量組可見腎小管輕度腫脹、炎癥細胞浸潤;但低、中劑量組肝臟和腎臟未見明顯病理改變。2.大黃提取物和大黃總蒽醌對大鼠尿液NGAL、KIM-1水平的影響大鼠灌胃給予大黃提取物1個月后,高、低劑量組雄性動物的尿液NGAL水平可見增高,其中高劑量組與正常組比較有顯著差異(P0.05),但雌性大鼠尿液NGAL未見明顯影響。雌雄合并的數(shù)據(jù)顯示,低劑量組和高劑量組尿中NGAL水平分別較正常組提高22.78%和51.53%。其中,二個劑量水平對雄性動物尿液NGAL升高作用較雌性動物強。大黃高劑量組雌、雄大鼠的尿液KIM-1水平均顯著降低(與正常組比較p0.01),但認為無毒理學意義。大鼠灌胃給予大黃總蒽醌10天后,各劑量組雌、雄動物的尿液NGAL水平均可見增高,可能與各劑量組的總蒽醌用藥劑量均較大有關。KIM-1水平未見有毒理學意義的變化。3.大黃提取物和大黃總蒽醌對腎臟Clusterin、OAT1、OAT2mRNA表達的影響大黃提取物灌胃給藥1個月,高劑量組腎臟組織的Clusterin mRNA表達較正常組明顯下降(p0.01),其中雄性、雌性動物分別較正常組下降33%和19%。低劑量組腎臟組織的Clusterin mRNA表達無明顯變化。大黃低劑量組雄性動物腎臟組織的OAT1 mRNA和OAT3 mRNA表達較正常組分別上調(diào)47%和62%。高劑量組雄性動物的OAT3 mRNA較正常組上調(diào)38%。大黃各劑量組給藥后,雌性動物腎臟組織OATl mRNA、OAT3 mRNA表達無明顯變化。大黃總蒽醌灌胃給藥10天,中、高劑量組雌性大鼠的腎臟ClusterinmRNA表達較正常組下降290%和26%。中、高劑量組雌性和雄性動物腎臟組織的OAT1 mRNA分別較對照組下調(diào)21%、42%、43%、70%。高劑量組雌性動物腎臟OAT3 mRNA表達較正常組下調(diào)44%。4.大黃總蒽醌對對氨基馬尿酸清除率的影響大黃總蒽醌5g/kg灌胃給藥10天后,進行PAH清除實驗。結(jié)果顯示,給藥組雌、雄動物各時間點血漿中PAH濃度均較對照組有所降低。雄性動物尿液中的PAH含量在給予PAH后前20min較對照組降低;雌性動物20～40 min和40-60min尿中PAH含量較對照組偏高。大黃，

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