【摘要】：吲哚胺2,3-雙加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)是色氨酸分解代謝的第一限速酶,可通過介導(dǎo)色氨酸的耗竭及其代謝產(chǎn)物犬尿氨酸的積累來誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的凋亡或功能紊亂,從而減弱機(jī)體的抗腫瘤免疫。因此,IDO1被認(rèn)為是腫瘤免疫治療藥物的一個重要靶標(biāo)。同時,作為有廣闊發(fā)展前景的免疫治療候選藥物,吲哚胺2,3-雙加氧酶1抑制劑,如Epacadostat和Indoximod等已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。尤其值得關(guān)注的是,小分子IDO1抑制劑與PD-1抗體的結(jié)合可以顯著提高腫瘤治療的客觀反應(yīng)率(ORR,objective response rate)。由于它是一種具有良好生物化學(xué)作用的單鏈催化酶,因此,IDO1被認(rèn)為是小分子免疫治療發(fā)展的一個極具吸引力的靶點(diǎn)。開發(fā)新型IDO1小分子抑制劑將會對臨床腫瘤免疫治療的發(fā)展產(chǎn)生積極影響。在第一部分實(shí)驗(yàn)中,為了發(fā)現(xiàn)和探索新型的靶向IDO1的小分子免疫治療藥物,我們通過PCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增人IDO1啟動子上游區(qū)域1245 bp基因片段,將其插入到pGL4.20-basic載體中構(gòu)建了 pGL4-IDO1-luc熒光素酶重組質(zhì)粒�；陔p熒光素酶報告基因方法建立IDO1抑制劑篩選模型,篩選能夠下調(diào)腫瘤細(xì)胞中IDO1表達(dá)的天然活性小分子化合物。采用MTT、Western blotting和LDH等方法探討陽性化合物的抗腫瘤作用及其對IDO1的調(diào)控機(jī)制�；衔锎ㄩ�(toosendanin,NS-180)能顯著下調(diào)IFN-γ誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞中IDO1表達(dá)而不能直接抑制IDO1的酶活性。在A549細(xì)胞中,川楝素可抑制IFN-γ誘導(dǎo)的STAT1的磷酸化和核轉(zhuǎn)位,從而在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)IFN-γ誘導(dǎo)的IDO1蛋白表達(dá)。細(xì)胞阻抗分析和LDH釋放實(shí)驗(yàn)表明,川楝素可促進(jìn)NK淋巴細(xì)胞對A549細(xì)胞的殺傷作用。綜上所述,篩選獲得的天然小分子川楝素是一類新型高效的IDO1抑制劑,它可能成為靶向IDO1的腫瘤免疫治療候選藥物。在第二部分實(shí)驗(yàn)中,為了發(fā)現(xiàn)和探索新型的靶向IDO1的小分子免疫治療藥物,我們首先設(shè)計合成了一系列新型的小檗堿(berberine,BBR)衍生物,包括酯類、酰胺類和磺酸類化合物。以IDO1為靶點(diǎn)對BBR衍生物的活性進(jìn)行了研究,檢測其是否抑制IFN-γ誘導(dǎo)的IDO1啟動子熒光素酶活性。構(gòu)效關(guān)系分析表明,在位置9使用叔碳、季碳或者剛性結(jié)構(gòu)基團(tuán)進(jìn)行取代,可能有利于增強(qiáng)其對IDO1啟動子活性的抑制效力。與BBR相比,2f、2i、2n、2o、8b等化合物對IDO1啟動子熒光素酶活性有較好的抑制作用,抑制率約為71-90%。Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了它們在蛋白水平抑制IDO1的表達(dá)。而且,化合物2i和2n通過增強(qiáng)NK淋巴細(xì)胞對A549細(xì)胞的殺傷作用顯示了其抗癌活性,這種抗癌活性是由于靶向下調(diào)IDO1的表達(dá),而不是因?yàn)榛衔锉旧韺549細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。初步的機(jī)制研究顯示化合物2i和2n能夠通過激活A(yù)MPK,抑制STAT1磷酸化,從而在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)IFN-γ誘導(dǎo)的IDO1表達(dá)。因此,我們認(rèn)為化合物2i和2n是一種很有前途的新型的IDO1抑制劑,它們可能對臨床腫瘤免疫治療的發(fā)展產(chǎn)生積極影響。
【圖文】：

ＩＤ０１基因啟動子包含了邋ＡＴＧ起始密碼子結(jié)合位點(diǎn)，包括兩個相距１０００邋ｎｔＧＡＳ序列、兩個ＡＰ－１結(jié)合位點(diǎn)。ＩＤ０１可分別直接或者間接地激活ＩＤＯｌ基因過ＰＣＲ擴(kuò)增了這段１２４５ｂｐ的ＩＤＯｌ組為模板，進(jìn)行ＰＣＲ，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)１％異性目的條帶，與預(yù)計相符，表明已獲取的ＩＤＯｌ基因片段與空白質(zhì)粒ＰＧＬ４行雙酶切。隨后將雙酶切后回收的ＩＤＮＡ連接酶進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)取質(zhì)粒進(jìn)行隨后的酶切鑒定。逡逑ｂｐ邋Ｍ邐１逡逑

對重組ＰＧＬ４－ＩＤ０１４ＵＣ質(zhì)粒的插入片段進(jìn)行測序，結(jié)果表明各酶切位點(diǎn)正確，逡逑經(jīng)比對后證實(shí)測序序列與ＧｅｎｅＢａｎｋ中報道的ＩＤ０１啟動子區(qū)序列相符。選取逡逑ｐＧＬ４－ＩＤ０１－ｌｕｃ測序的部分截圖（圖３N３），下劃線序列為上游引物，表明重組質(zhì)逡逑粒ｐＧＬ４－ＩＤ０１－ｌｕｃ構(gòu)建成功。對測序得到的ＩＤ０１啟動子區(qū)進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，，該逡逑啟動子區(qū)含有干擾素刺激反應(yīng)兀件１邋／２邋（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ邋ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｅｌｅｍｅｎｔ，逡逑２６逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 杜見益;;黃連素治療心律失常108例的療效觀察[J];海南醫(yī)學(xué);2006年07期

2 婁金麗;邱全瑛;郝鈺;徐泊文;何秀娟;吳s

本文編號：2658712