【摘要】：多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一種由于漿細(xì)胞的克隆性增生所造成的造血系統(tǒng)腫瘤,好發(fā)于中老年人,多數(shù)患者出現(xiàn)腎功能不全、骨病變、貧血、免疫缺陷等臨床癥狀。MM發(fā)病率居于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位,其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞增殖凋亡失衡的關(guān)系密切,細(xì)胞凋亡途徑主要有線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑3條通路。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,也是抗腫瘤藥物重要作用機(jī)制之一。臨床治療MM的方法主要是通過(guò)化療和自體造血干細(xì)胞移植,來(lái)改善患者的臨床癥狀,減緩疾病的進(jìn)展。近年來(lái),新型的靶向藥物已經(jīng)被逐漸應(yīng)用于MM的臨床治療中,雖然取得了良好的治療效果,但是仍然不能避免產(chǎn)生耐藥性和復(fù)發(fā),并且化療產(chǎn)生的毒副作用嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,因此新藥物研發(fā)仍然具有重要意義。薯蕷皂苷元(Diosgenin,Dio)是在薯蕷科植物中分離得到的甾體皂苷元,是多種甾體類激素的生產(chǎn)原料。目前,藥理學(xué)研究表明,Dio在擴(kuò)張血管、免疫調(diào)節(jié)、降低血脂、抑制腫瘤增殖等方面有重要作用,尤其是抗腫瘤作用越來(lái)越受到關(guān)注。研究表明,Dio的抗腫瘤作用廣泛,能夠抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞、黑色素瘤A375-S細(xì)胞、人慢性粒細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),并誘導(dǎo)其凋亡,此外Dio誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡涉及了Fas/Fas L、細(xì)胞色素C、p53、Caspase、NF-κB等多種信號(hào)因子,但是Dio是否對(duì)MM細(xì)胞也具有抑制作用,目前還尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。因此本課題擬以多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察Dio對(duì)其是否有誘導(dǎo)凋亡作用并探討其作用機(jī)制。目的:觀察Dio對(duì)RPMI8226細(xì)胞凋亡的影響,探討Dio誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,為Dio的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:采用CCK8法檢測(cè)不同濃度、不同作用時(shí)間的Dio對(duì)于RPMI8226細(xì)胞增殖的影響,并篩選藥物有效的抑制濃度;以10nmol/L硼替佐米(Bortezomib,BTZ)為陽(yáng)性對(duì)照組,采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)不同濃度Dio作用于RPMI8226細(xì)胞后凋亡情況的變化;采用RT-PCR方法檢測(cè)不同濃度Dio作用于RPMI8226細(xì)胞后Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、細(xì)胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C)m RNA表達(dá)水平的變化;采用Western Blot方法檢測(cè)不同濃度Dio作用于RPMI8226細(xì)胞后Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C蛋白表達(dá)水平的變化;數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行分析。結(jié)果:1 CCK-8檢測(cè)Dio對(duì)RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制率1.1 RPMI8226細(xì)胞在Dio作用下培養(yǎng)24h后,與空白組相比,Dio藥物組細(xì)胞出現(xiàn)一定抑制作用(P0.05),5、10、20、30、40、50μmol/L Dio藥物組抑制率分別為4.96%、11.95%、24.09%、36.59%、41.76%、48.96%。1.2 RPMI8226細(xì)胞在Dio作用下培養(yǎng)48h后,與空白組相比,Dio藥物組出現(xiàn)一定的抑制作用(P0.05),5、10、20、30、40、50μmol/L Dio藥物組抑制率分別為6.42%、11.27%、26.02%、49.29%、67.04%、86.50%。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Dio對(duì)RPMI8226細(xì)胞增殖有一定的抑制作用,并且具有時(shí)間劑量依賴性。根據(jù)Dio對(duì)RPMI8226細(xì)胞的抑制率,所選擇3個(gè)Dio劑量分別是10、20、30μmol/L。2流式細(xì)胞儀檢測(cè)RPMI8226細(xì)胞的凋亡率與空白組相比,BTZ組RPMI8226細(xì)胞凋亡比率升高(P0.05),10μmol/L Dio組、20μmol/L Dio組和30μmol/L Dio組細(xì)胞凋亡比率比空白組升高(P0.05),具有劑量依賴性。20μmol/L Dio組和30μmol/L Dio組凋亡比率比BTZ組升高(P0.05),具有劑量依賴性。3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cty-C m RNA的表達(dá)情況與空白組相比,BTZ組Bax/Bcl-2、Caspase-9、Cty-C m RNA表達(dá)比空白組上調(diào)(P0.05),Caspase-3 m RNA無(wú)明顯變化(P0.05);10μmol/L Dio組、20μmol/L Dio組和30μmol/L Dio組Bax/Bcl-2、Cty-C m RNA表達(dá)較空白組上調(diào)(P0.05),具有劑量依賴性;20μmol/L Dio組和30μmol/L Dio組Caspase-3、Caspase-9 m RNA明顯升高(P0.05),具有劑量依賴性。與BTZ組相比,10μmol/L Dio組、20μmol/L Dio組和30μmol/L Dio組Caspase-3 m RNA均升高(P0.05),具有劑量依賴性;20μmol/L Dio組和30μmol/L Dio組Caspase-9 m RNA表達(dá)比BTZ組上升(P0.05),具有劑量依賴性;10μmol/L Dio組、20μmol/L Dio組和30μmol/L Dio組Cty-C m RNA與BTZ組相比,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。BTZ組Bax/Bcl-2上調(diào)比10μmol/L Dio組、20μmol/L Dio組、30μmol/L Dio組更明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.Western Blot法檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C蛋白的表達(dá)情況與空白組相比,BTZ組Bax/Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C蛋白表達(dá)升高(P0.05);10μmol/L Dio組、20μmol/L Dio組、30μmol/L Dio組Bax/Bcl-2、Caspase-3、Cyt-C蛋白表達(dá)比空白組升高(P0.05),有劑量依賴性;30μmol/L Dio組Caspase-9蛋白比空白組上調(diào)(P0.05),有劑量依賴性。20μmol/L Dio組和30μmol/L Dio組Bax/Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)比BTZ組上調(diào)(P0.05),有劑量依賴性;30μmol/L Dio組Caspase-9、Cyt-C的蛋白表達(dá)量比BTZ組上調(diào)(P0.05),有劑量依賴性。結(jié)論:1.薯蕷皂苷元對(duì)多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞增殖有抑制作用,并可以誘導(dǎo)其凋亡。2.薯蕷皂苷元可能通過(guò)激活線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路,以Caspase依賴的方式誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2658178