【摘要】：背景:肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化、肝細(xì)胞癌發(fā)展的一個動態(tài)過程,若發(fā)生早期不給予積極有效的治療,一旦發(fā)展成為肝硬化甚至肝壞死階段,治療將更加困難。肝纖維化是肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度沉積的結(jié)果,已知肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSCs)的活化是形成ECM的主要原因,很多因子均參與了HSCs的活化,其中影響最強烈的為直接激活HSCs產(chǎn)生ECM的轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和促進(jìn)HSCs增殖、遷移的血小板衍生生長因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)。肝纖維化是一個多種細(xì)胞因子多種信號通路共同介導(dǎo)的復(fù)雜的慢性疾病,探究肝纖維化的發(fā)病機制,開發(fā)有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物具有重要的臨床價值。近年來,我國的中醫(yī)藥在抗肝纖維化防治中發(fā)揮重要作用,愈肝龍(Yu Gan Long,YGL)作為一種傳統(tǒng)的純中草藥復(fù)方,多年來,在臨床上被用于治療急慢性肝炎、初期肝硬化和肝纖維化等肝臟疾病,然而因其抗肝纖維化作用機制至今仍不明確,一直未能廣泛推廣應(yīng)用。目的:本文旨在通過運用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl_4)建立大鼠肝纖維化模型,初步明確愈肝龍減輕肝纖維化的藥效及其作用機制,為其進(jìn)一步推廣使用提供科學(xué)依據(jù)。方法:將40%的CCl_4溶液(四氯化碳:橄欖油=2:3)皮下注射Sprague Dawley(SD)大鼠誘導(dǎo)肝纖維化模型,四氯化碳溶液首劑量為5 kg/m L,第二次開始劑量為3 kg/m L,每周2次,共持續(xù)8周,Control組給予等體積橄欖油溶液。第9周至第20周,除每周2次四氯化碳造模外,愈肝龍各給藥組每天灌胃相應(yīng)劑量的愈肝龍浸膏;干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)組每天皮下注射IFN-γ;Control組大鼠灌胃等體積的生理鹽水,每天灌胃1次,一共12周。實驗期滿,取出所有大鼠的血清、肝臟、脾臟、腎臟、肺和胸腺,計算臟器系數(shù)。生化試劑盒檢測大鼠血清中ALT、AST、TBIL的含量;酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測大鼠血清中四型膠原蛋白(collagen Ⅳ,Col Ⅳ)、三型前膠原蛋白(type Ⅲ precollagen,PC Ⅲ)、透明質(zhì)酸(hyaluronuc acid,HA)、層黏蛋白(laminin,LN)、TGF-β1、PDGF-BB、腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor-a,TNF-a)、IL-1b、IL-6、IL-4、IL-17A和IFN-γ的含量;蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色和馬森(Masson)染色用來判斷肝臟組織的病理生理結(jié)構(gòu)變化;免疫組化染色檢測大鼠肝臟中α-平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)、TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)、p-STAT3、p-AKT和p-ERK1/2的表達(dá);Western blot檢測大鼠肝臟中基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1)、MMP9、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4、Smad7、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Ras、Raf-1、p-Raf-1、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38和p-p38蛋白的表達(dá)。結(jié)果:與Control組比較,ALT、AST和TBIL的含量在CCl_4組顯著升高(p0.01),與CCl_4組相比,0.5 g/kg YGL和1.0 g/kg YGL明顯降低肝纖維化大鼠血清中ALT、AST和TBIL的含量(p0.05或p0.01);與Control組比較,Col Ⅳ、PC Ⅲ、HA和LN的含量在CCl_4組顯著升高(p0.01),與CCl_4組相比,Col Ⅳ、HA和LN的含量在0.25 g/kg YGL、0.5 g/kg YGL和1.0 g/kg YGL組明顯降低(p0.05或p0.01),PC Ⅲ含量在1.0 g/kg YGL組顯著降低(p0.01);HE結(jié)果顯示,Control組的肝臟結(jié)構(gòu)相對正常,各種纖維細(xì)胞排列比較整齊,而CCl_4組肝細(xì)胞出現(xiàn)水腫現(xiàn)象,且伴隨有脂肪變性,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞或消失,愈肝龍灌胃后,各劑量組肝臟的病變程度均有不同程度的改善;Masson染色結(jié)果顯示CCl_4致肝臟組織中膠原的廣泛積累,與CCl_4組相比,愈肝龍灌胃后,各劑量組的肝臟組織膠原沉積均有降低;肝臟組織中α-SMA和TIMP1的表達(dá)在愈肝龍灌胃后降低,而MMP2和MMP9的表達(dá)升高;各劑量組愈肝龍灌胃后,大鼠血清和肝臟中TGF-β1的表達(dá)與CCl_4組相比均有所減少;與CCl_4組相比,肝纖維化大鼠肝臟中與TGF-β1/Smad信號通路相關(guān)的p-Smad2、p-Smad3和Smad4的表達(dá)有所下調(diào),Smad7的表達(dá)有所上調(diào);愈肝龍下調(diào)肝纖維化大鼠血清中PDGF-BB的表達(dá),下調(diào)肝臟中由PDGF-BB介導(dǎo)的Ras、p-Raf-1、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38、p-PI3K、p-AKT、p-JAK1和p-STAT3蛋白的表達(dá);此外,愈肝龍下調(diào)肝纖維化大鼠血清中的TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-4和IL-17A的含量,上調(diào)IFN-γ的含量;愈肝龍下調(diào)肝纖維化大鼠肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt和GATA3的表達(dá),上調(diào)T-bet的表達(dá)。結(jié)論:1、愈肝龍通過調(diào)控肝纖維化大鼠肝臟組織TIMPs和MMPs的平衡促進(jìn)ECM的降解;2、愈肝龍通過調(diào)控TGF-β1/Smad、JAK1/STAT3、PI3K/AKT和Ras/ERK信號達(dá)到抗肝纖維的作用;3、愈肝龍通過調(diào)節(jié)肝臟組織Th1、Th2和Th17細(xì)胞的平衡進(jìn)而減輕CCl_4誘導(dǎo)的肝纖維化。本研究明確了愈肝龍抗肝纖維化的藥效,初步闡明了其抗肝纖維的作用機制。
【圖文】：

圖 1 愈肝龍對肝纖維化大鼠肝臟外觀的影響。Fig.1. YGL influences the appearance of liver tissues.3.3 愈肝龍對肝纖維化大鼠主要臟器的臟器系數(shù)的影響

圖 2 愈肝龍對肝纖維化大鼠主要臟器的臟器系數(shù)影響。（A-E）肝臟、腎臟、臟、肺、胸腺的臟器系數(shù)。數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，，▲p<0.05 和▲▲p<0.01 Control 組；#p<0.05 和##p<0.01 vs CCl4組。Fig.2. YGL influences the organ coefficient of the main organs in liver fibrosis ra
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2657921