發(fā)布時間：2020-05-09 13:48

【摘要】：第一部分小檗堿對Ⅱ型糖尿病腦病模型大鼠軸突病變的影響及機制研究背景:糖尿病腦病(diabetic encephalopathy)是糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,主要臨床表現(xiàn)為進行性認知功能障礙,主要病理學(xué)特征為腦內(nèi)出現(xiàn)阿爾茨海默病(Alzheimer Disease,AD)樣病理改變:即β淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)沉積形成的老年斑(SP)和tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)。但其確切的發(fā)病機制尚未明確。近年來大量研究表明,軸突病變早于AD的兩個特征性病理改變,被認為是AD的重要發(fā)病機制之一,但是軸突病變是否參與了糖尿病腦病的發(fā)病進程卻不得而知,有待進一步研究。又有研究顯示:小檗堿能有效緩解Ⅱ型糖尿病大鼠胰島素抵抗而達到預(yù)防和治療糖尿病作用。小檗堿可穿過血腦屏障并在海馬區(qū)累積,具有緩解糖尿病中樞神經(jīng)損傷的效應(yīng),但其作用機制有待進一步闡明。本研究旨在體內(nèi)外模型中探討高糖導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生軸突病變的分子機制以及小檗堿對神經(jīng)元軸突損傷的保護作用。實驗方法:首先,利用高糖/高脂飲食和鏈脲佐菌素(STZ)注射誘導(dǎo)建立Ⅱ型糖尿病腦病大鼠模型。隨后,給予模型大鼠灌胃小檗堿治療10周,通過Morris水迷宮實驗檢測空間學(xué)習(xí)記憶能力;同時,采用體內(nèi)神經(jīng)元示蹤實驗檢測神經(jīng)元軸突病變;免疫組織化學(xué)以及Western-blot技術(shù)檢測蛋白定位與表達。其次,結(jié)合體外原代神經(jīng)元培養(yǎng),運用全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)檢測高糖和小檗堿對神經(jīng)元軸突運輸?shù)挠绊?并進一步運用PI3K抑制劑LY294002和胰島素信號通路激活劑insulin探討其中可能的分子機制。結(jié)果:體內(nèi)和體外實驗表明,在STZ誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病性腦病模型大鼠的海馬組織中,神經(jīng)元軸突出現(xiàn)損傷,且伴隨tau蛋白的過度磷酸化,隨后導(dǎo)致軸突運輸損傷和認知功能障礙。小檗堿顯著降低Ⅱ型糖尿病腦病模型大鼠外周血糖和血清胰島素水平,從而緩解了外周胰島素抵抗。同時,小檗堿可顯著改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙和大腦神經(jīng)元軸突病變。進一步的研究結(jié)果顯示:小檗堿可顯著降低模型大鼠tau蛋白磷酸化水平,且可通過上調(diào)PI3K/Akt信號通路而降低GSK3β的活性。在體外,給予高濃度葡萄糖(45 mM)處理24小時的原代神經(jīng)元中,PI3K/Akt信號通路失活導(dǎo)致GSK3β抑制性位點Ser9的磷酸化水平顯著下降,GSK3β活性顯著增加,tau蛋白磷酸化水平顯著增高。同時給予小檗堿進行干預(yù)后,PI3K/Akt磷酸化程度較高糖組顯著增強,GSK3β抑制性位點Ser9的磷酸化水平顯著增加,tau蛋白磷酸化水平較高糖組顯著降低。且小檗堿干預(yù)可顯著改善高糖誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元軸突運輸障礙。進一步采用PI3K抑制劑LY294002和/或胰島素信號通路激活劑insulin處理原代神經(jīng)元,結(jié)果顯示:給予LY294002處理后可有效阻斷PI3K/Akt信號通路,LY294002+小檗堿處理組tau蛋白磷酸化水平較小檗堿干預(yù)組顯著增高,而insulin處理組可有效逆轉(zhuǎn)LY294002對小檗堿的阻斷效應(yīng)。結(jié)論:小檗堿可通過上調(diào)PI3K/Akt/GSK3β信號通路降低tau蛋白磷酸化水平,對神經(jīng)元軸突損傷具有保護作用,從而改善Ⅱ型糖尿病腦病模型大鼠的認知功能。第二部分小檗堿對Ⅱ型糖尿病腦病模型大鼠Aβ產(chǎn)生的影響及機制研究背景:隨著物質(zhì)生活水平和疾病治療水平的提升,糖尿病患者生存期明顯延長。同時,糖尿病引起的并發(fā)癥也逐漸引起人們的重視。其中,糖尿病并發(fā)癥又以神經(jīng)病變的發(fā)病率最高。糖尿病腦病,一種被證實的糖尿病并發(fā)癥,與CNS中逐漸發(fā)展的終末器官損傷有關(guān),且伴隨認知功能障礙,嚴重降低糖尿病患者生活質(zhì)量。有文獻報道,糖尿病模型中的慢性炎癥浸潤導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生;且外周胰島素抵抗導(dǎo)致記憶、執(zhí)行功能以及語言理解等方面出現(xiàn)損傷;同時阿爾茨海默病(AD)的標(biāo)志物—寡聚肽毒性蛋白Aβ42也出現(xiàn)增加。此外,又有文獻報道,內(nèi)側(cè)前額葉皮層(m PFC)具有協(xié)調(diào)信息監(jiān)督和處理加工的能力,且大腦m PFC中的環(huán)路與各種記憶形式存在直接關(guān)聯(lián)。臨床研究表明,T2D中糟糕的執(zhí)行功能和記憶損傷主要與m PFC、顳側(cè)和小腦區(qū)的葡萄糖攝取/代謝密切相關(guān)。小檗堿,一種來源于天然產(chǎn)物中的小分子化合物,在糖尿病外周組織中已經(jīng)表現(xiàn)出很好的抗炎和降血糖作用。但是在中樞系統(tǒng)中,特別是在糖尿病大鼠m PFC中的作用鮮有報到。為了更好地理解小檗堿對糖尿病患者認知功能的影響,我們采用STZ誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病模型,研究小檗堿參與拮抗糖尿病大鼠m PFC的炎癥反應(yīng)以及改善胰島素抵抗的分子機制。方法:在給予糖尿病大鼠灌胃小檗堿(200mg/Kg/d)后。采用條件恐懼試驗進行認知行為評價,Western-blot檢測相關(guān)蛋白表達。通過正電子發(fā)射斷層掃描(PET)成像測試糖尿病大鼠m PFC中的葡萄糖攝取情況。通過商用ELISA試劑盒測定炎癥介質(zhì)的表達水平。組織免疫熒光和免疫組化分別檢測NF-κB在mPFC中的轉(zhuǎn)位和Aβ42的生成。結(jié)果:首先,我們在活體中進行PET實驗,發(fā)現(xiàn)小檗堿促進糖尿病大鼠m PFC對葡萄糖的攝取。隨后,通過Western和免疫熒光等實驗,證明小檗堿可顯著抑制糖尿病大鼠m PFC中炎癥介質(zhì)釋放,緩解胰島素抵抗以及MAPK信號通路的激活;同時,PKCη和PKCε蛋白的表達水平和NF-κB在神經(jīng)元中的轉(zhuǎn)位得到有效抑制。另外,神經(jīng)元特異性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT3也被顯著提高2-3倍。此外,小檗堿還降低了淀粉樣前體蛋白(APP)和BACE-1的表達以及寡聚體Aβ42的產(chǎn)生。最后,行為學(xué)數(shù)據(jù)顯示,通過小檗堿治療,加速了糖尿病大鼠對信息的加工處理并強化了記憶功能,從而緩解了認知障礙。結(jié)論:小檗堿可以通過抑制糖尿病大鼠m PFC中炎癥通路的激活和胰島素抵抗的發(fā)生,從而改善了糖尿病大鼠認知功能的損傷。
【圖文】：

65igure 8. Possible mechanism of berberine for ameliorating the cognitive impairmen T2D rats.圖 8.小檗堿緩解 T2D 大鼠認知功能損傷的可能分子機制。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5;R-332

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