【摘要】：中藥鉤吻(Gelsemium elegans)是馬錢科(Loganiaceae)植物胡蔓藤的全草,中醫(yī)用于治療風濕痹痛和神經(jīng)痛等。近年來鉤吻因其鎮(zhèn)痛效能僅次于嗎啡且無成癮性,成為了研究的熱點。然而,鉤吻在臨床應(yīng)用中常發(fā)生中毒事件,吲哚型生物堿既是其活性成分,又是毒性成分。因此,如何減毒是鉤吻安全應(yīng)用需解決的關(guān)鍵問題。細胞色素P450酶(CYP酶)對藥物的減毒有重要作用,介導(dǎo)著許多有毒中藥的減毒機制�；诖�,本論文以鉤吻中的3個毒效成分(鉤吻素子(KOU)、鉤吻素甲(GA)及胡蔓藤堿甲(HMT))為研究對象,主要進行了鉤吻生物堿的CYP酶代謝及其毒性相關(guān)性研究,旨在為揭示鉤吻減毒的科學內(nèi)涵,提高藥物療效和安全性提供參考依據(jù)。主要研究內(nèi)容如下所述:一、鉤吻生物堿的CYP酶代謝機理研究在體外肝微粒體作用下,KOU、GA、HMT分別至少生成4、5、4個代謝產(chǎn)物,其代謝途徑相似,包括去甲基、脫氫、羥基化、去甲基脫氫與氧化�；瘜W抑制劑及人源化重組CYP酶實驗的結(jié)果表明,參與三個單體代謝的主要CYP酶亞型均為CYP3A4/5。通過小鼠腹腔注射地塞米松或酮康唑,動物體內(nèi)的CYP3A4/5活性能被相應(yīng)地誘導(dǎo)或抑制。鉤吻生物堿在CYP3A4/5活性被誘導(dǎo)的微粒體中的代謝均顯著升高,而在CYP3A4/5活性被抑制的微粒體中,其代謝率均顯著降低(P0.05),這進一步從體內(nèi)證明了鉤吻生物堿的主要代謝酶是CYP3A4/5。為了研究不同動物種屬(人、大鼠、小鼠)的肝微粒體代謝酶對GA代謝的影響,我們分別考察了 2.5-640 μM的GA在這三種動物肝微粒體中的代謝速率。首先通過大鼠灌胃給藥GA,收集尿液糞便,處理分離純化得到其主要代謝產(chǎn)物,經(jīng)核磁共振鑒定為4-N-去甲基GA。用4-N-去甲基GA的含量變化表示GA在肝微粒體中的代謝速率,結(jié)果表明,GA在三種動物肝微粒體中的代謝均符合經(jīng)典米式方程,代謝速率快慢依次為:人肝微粒體(705.6±36.2 pmol/mg/min)小鼠肝微粒體(632.1 ±16.0 pmol/mg/min)大鼠肝微粒體(229.1 ±15.9 pmol/mg/min)。這表明GA的體外代謝有顯著性種屬差異。為了考察HMT在大鼠體內(nèi)的處置特征,本研究建立了靈敏的UPLC-MS/MS檢測方法,并計算了 HMT在大鼠體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)。HMT在大鼠體內(nèi)吸收迅速,口服給藥HMT12.50±2.74min后,其血藥濃度達到峰值(Cmax 28.49±6.65nmol/L),消除半衰期(T1/2)為82.22±35.55min。我們推測其血藥濃度的迅速降低與藥物代謝酶的代謝作用密切相關(guān)。二、鉤吻生物堿的CYP酶代謝與其毒性相關(guān)性研究首先,采用MTT法測定了鉤吻生物堿對L-02人正常肝細胞的增殖毒性,結(jié)果表明,KOU和GA在較高濃度(600-800 μM)時對L-02細胞的增殖有不同程度的抑制作用(P0.001)。而HMT對L-02細胞增殖有明顯的抑制作用,并呈現(xiàn)劑量依賴性(P0.001)。其次,給小鼠腹腔注射酮康唑(KET),形成體內(nèi)CYP3A4/5活性抑制的模型。實驗組小鼠給予腹腔注射KET四天后,再灌胃給予鉤吻生物堿;對照組小鼠直接灌胃給予相同劑量的鉤吻生物堿。結(jié)果表明,對照組小鼠并未出現(xiàn)死亡;而實驗組小鼠在14天內(nèi)的生存率降低至0%(GA)和20%以下(HMT)。這表明抑制CYP3A4/5活性,鉤吻生物堿的毒性顯著增加。最后,為了進一步考察CYP酶代謝對GA毒性的作用,我們分別給予斑馬魚相同濃度的GA及代謝物4-N-去甲基GA。結(jié)果顯示,GA的濃度為750 μM時,斑馬魚有部分死亡,出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng);而相同濃度下,代謝物4-N-去甲基GA對斑馬魚則無毒性反應(yīng)。經(jīng)計算,GA及代謝物對斑馬魚的半數(shù)致死濃度分別為0.81和7.42 mg/mL。該結(jié)果表明經(jīng)CYP酶代謝后,GA轉(zhuǎn)化成為毒性更小的代謝物。綜上所述,本研究首次證明鉤吻生物堿在人、鼠肝微粒中的代謝途徑主要為去甲基、脫氫、羥基化、去甲基脫氫和氧化反應(yīng),且參與其最主要的代謝酶亞型為CYP3A4/5。同時證明鉤吻生物堿經(jīng)過CYP3A4/5代謝后,毒性顯著降低。本研究結(jié)果可為鉤吻生物堿的毒性預(yù)警及臨床安全應(yīng)用提供理論依據(jù)。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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