【摘要】：背景腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是指起源于腎臟上皮細胞的癌癥,在腎臟惡性腫瘤中占比超過90%,包含了超過10種以上的組織病理學及分子病理學的亞型,其中腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,cc RCC)是最常見的病理類型,研究表明,大約75%的腎細胞癌是腎透明細胞癌。流行病學調查表明,在過去的20多年中,腎細胞癌全球發(fā)病率每年增加2%;世界范圍內,腎細胞癌年齡標化患病率和死亡率分別是每10萬人6人患病和每10萬人2.1人死亡。盡管腎細胞癌診療技術取得很大進展,大約有20%~30%的腎細胞癌患者出現(xiàn)遠處轉移;出現(xiàn)轉移的腎細胞癌患者預后較差,5年存活率大約8%。隨著對腎細胞癌發(fā)病機制認識的加深,近年來發(fā)展出了腎細胞癌的免疫療法和靶向療法,但是到目前為止,沒有一種藥物能夠取得100%的反應率和疾病的持久的緩解,對腎細胞癌的治療仍需要發(fā)展新的輔助療法。中國傳統(tǒng)醫(yī)學(Chinese traditional medicine,CTM)為現(xiàn)代西方醫(yī)學的發(fā)展提供了一種替代的路徑,特別是其中的中草藥(herbal medicine),近年來在治療許多慢性疾病包括腫瘤等方面中草藥及其提取的活性成分得到越來越多的關注和研究。蟲草素(cordycepin)是從中國傳統(tǒng)中藥冬蟲夏草(Cordyceps militaris)中提取的主要活性成分,過去在肺癌、乳腺癌、卵巢癌和白血病等腫瘤中的的研究表明,蟲草素具有廣譜的抗腫瘤活性,但蟲草素在腎細胞癌中的抗腫瘤活性及其作用的相關分子機制仍需要進一步深入研究。目的探討蟲草素(cordycepin)對腎透明細胞癌存活、遷移能力的影響,并初步研究蟲草素在腎透明細胞癌中抗腫瘤作用的分子機制,為未來蟲草素輔助治療在腎細胞癌方面的潛在臨床應用奠定實驗理論基礎。方法1.不同濃度(10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml,50μg/ml)蟲草素處理Caki-1腎透明細胞癌細胞48小時,CCK-8(cell counting kit-8)細胞活力檢測試劑測定細胞存活情況;Caspase-3半胱天冬酶活性測定試劑盒測定細胞中Caspase-3活性。2.30μg/ml的蟲草素和50μmol/L的半胱天冬酶抑制劑z-VAD-fmk同時處理Caki-1腎透明細胞癌細胞48小時,設空白對照和半胱天冬酶抑制劑z-VADfmk未處理對照,CCK-8細胞活力檢測試劑盒測定細胞活力;Western Blot技術檢測凋亡標志蛋白PARP(poly ADP-ribose polymerase)和caspase-3的切割。3.Transwell小室細胞遷移實驗分析10μg/ml的蟲草素處理24小時和48小時對Caki-1腎透明細胞癌細胞遷移能力的影響。4.10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml的蟲草素處理Caki-1腎透明細胞癌細胞,Western Blot技術檢測蟲草素對磷酸酶PTEN(Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10)水平、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt磷酸化水平的影響;實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,Q-PCR)檢測蟲草素處理對Caki-1腎透明細胞癌細胞中micor-RNA-21(mi R-21)表達水平的影響。5.通過轉染mi R-21 mimic或者PTEN小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA)在Caki-1腎透明細胞癌細胞中降低PTEN表達,Western Blot實驗驗證PTEN敲低表達效果,CCK-8細胞活力測定試劑盒測定在Caki-1腎透明細胞癌細胞中敲低PTEN表達對蟲草素促進Caki-1腎透明細胞癌細胞凋亡性死亡的影響;Transwell小室細胞遷移實驗檢測在Caki-1腎透明細胞癌細胞中敲低PTEN表達對蟲草素抑制Caki-1腎透明細胞癌細胞遷移的影響。結果1.CCK-8細胞活力測定實驗結果顯示,與對照相比,10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml,50μg/ml蟲草素處理Caki-1腎透明細胞癌細胞48小時,Caki-1細胞活力明顯下降(P0.05 vs.對照),呈濃度依賴模式;隨著蟲草素處理濃度的逐漸升高,Caki-1腎透明細胞癌細胞裂解液中凋亡標志物caspase-3蛋白活性逐漸升高(P0.05 vs.對照)。在50μmol/L的半胱天冬酶抑制劑z-VAD-fmk存在的情況下,蟲草素(30μg/ml)誘導的Caki-1腎透明細胞癌細胞死亡被顯著抑制(P0.05);Western Blot實驗結果顯示30μg/ml蟲草素處理Caki-1腎透明細胞癌細胞導致凋亡相關蛋白PARP的切割和caspase-3半胱天冬酶的切割激活,而50μmol/L的半胱天冬酶抑制劑z-VAD-fmk處理可以顯著抑制PARP和caspase-3蛋白的切割。2.Transwell小室細胞遷移實驗結果顯示,與對照相比,10μg/ml的蟲草素處理能顯著抑制Caki-1腎透明細胞癌細胞的跨膜遷移(P0.05 vs.對照)。3.Western Blot實驗結果表明,與對照相比,10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml的蟲草素處理Caki-1腎透明細胞癌細胞能顯著上調PTEN表達水平(P0.05 vs.對照)和下調蛋白激酶Akt磷酸化水平(P0.05 vs.對照),且呈一定的濃度依賴的模式。實時熒光定量PCR檢測結果顯示,與對照相比,隨著蟲草素作用濃度(10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml)的升高,Caki-1腎透明細胞癌細胞mi R-21表達水平逐漸降低(P0.05 vs.對照)。4.Western Blot實驗結果顯示,在Caki-1腎透明細胞癌細胞中轉染mi R-21mimic或者PTEN si RNA均可降低PTEN蛋白表達水平;CCK-8細胞活力測定結果表明,mi R-21 mimic或者PTEN si RNA轉染Caki-1腎透明細胞癌細胞均可抑制30μg/ml的蟲草素處理誘導的細胞死亡(P0.05);Transwell小室細胞遷移實驗結果顯示,mi R-21 mimic或者PTEN si RNA轉染Caki-1腎透明細胞癌細胞均可減弱10μg/ml的蟲草素處理對細胞遷移的抑制(P0.05)。結論蟲草素(cordycepin)處理腎透明細胞癌細胞系Caki-1細胞可降低mi R-21表達,升高PTEN磷酸酶表達;通過調控mi R-21和PTEN表達水平,蟲草素可誘導腎透明細胞癌細胞系Caki-1的凋亡性細胞死亡,抑制腎透明細胞癌細胞系Caki-1的遷移能力;蟲草素在治療腎細胞癌方面具有潛在的臨床應用價值。
【圖文】：

蟲草素（cordycepin）誘導的Caki-1腎透明細胞癌細胞死亡

蟲草素（cordycepin）處理Caki-1細胞對Caspase-3活性的影響
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2655630