發(fā)布時(shí)間：2020-05-08 19:46

【摘要】：目的:巨噬細(xì)胞極化與感染、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),現(xiàn)有研究顯示巨噬細(xì)胞極化有望成為疾病治療的重要干預(yù)靶點(diǎn)。中草藥貓爪草具有抗瘤、抗結(jié)核及抗炎等功效,用于輔助治療結(jié)核、肺癌、惡性淋巴瘤等疾病。研究發(fā)現(xiàn),貓爪草可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能,但其對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響作用尚未見(jiàn)明確報(bào)道。本課題擬用貓爪草醇類提取物刺激小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞,了解貓爪草對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響作用,探討貓爪草醇類提取物中可影響巨噬細(xì)胞極化的主要成分,并初步研究其相關(guān)作用機(jī)制。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)貓爪草相關(guān)臨床用藥奠定研究基礎(chǔ),也可為后續(xù)深入探討結(jié)核、腫瘤等疾病的中醫(yī)治療提供科學(xué)依據(jù)。方法:1.貓爪草醇提取物對(duì)小鼠骨髓來(lái)源M0型巨噬細(xì)胞極化的影響設(shè)置六組濃度梯度的RTR分別誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源M0型巨噬細(xì)胞,采用CCK8技術(shù)檢測(cè)RTR對(duì)巨噬細(xì)胞活性影響,尋找RTR作用巨噬細(xì)胞的最佳濃度;以此濃度誘導(dǎo)M0型巨噬細(xì)胞,孵育0 h、12 h、24 h、36 h、48h、72 h,觀察巨噬細(xì)胞的形態(tài)改變;Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)Arg-1、IL-10、TGF-β、i NOS、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子m RNA表達(dá)水平,ELISA技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)上清培養(yǎng)液中細(xì)胞因子(TNF-α、IL-10、TGF-β1)分泌水平變化,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)F4/80、CD206、NOS2分子表達(dá)水平。2.貓爪草醇類提取物中影響巨噬細(xì)胞極化的主要成分篩選高效液相等技術(shù)分離并鑒定RTR全成分,篩選出可能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化的單體成分。取其最適濃度分別誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞24h,Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)M1/M2型相關(guān)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子m RNA相對(duì)表達(dá)水平,篩選出與RTR刺激小鼠骨髓來(lái)源M0型巨噬細(xì)胞向M1型極化可能的單體化合物為棕櫚酸(Palmitic Acid,PA),小毛茛內(nèi)酯(Ternatlide,Tern)。3.PA/Tern對(duì)小鼠骨髓來(lái)源M0型巨噬細(xì)胞極化的影響采用CCK8技術(shù)檢測(cè)PA/Tern的巨噬細(xì)胞毒性,尋找其作用巨噬細(xì)胞的最佳濃度;以此濃度孵育24h,觀察巨噬細(xì)胞的形態(tài)改變;Real-time PCR檢測(cè)M1相關(guān)因子(i NOS、IL-6和TNF-α等)及M2相關(guān)細(xì)胞因子(Arg-1、IL-10、TGF-β等)m RNA表達(dá)水平,ELISA檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-10、TGF-β1細(xì)胞因子分泌水平變化,FCM檢測(cè)F4/80、CD206、NOS2分子表達(dá)水平。4.PA/Tern分別在貓爪草誘導(dǎo)M0巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中的作用根據(jù)PA/Tern在貓爪草中的成分比例,分別以工作濃度誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源M0型巨噬細(xì)胞0-72h,Real-time PCR檢測(cè)M1/M2巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子m RNA表達(dá)水平,ELISA檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-10、TGF-β1細(xì)胞因子分泌水平變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)F4/80、CD206、NOS2分子表達(dá)水平。5.PA與Tern在貓爪草誘導(dǎo)M0巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中的相互作用以PA/Tern工作濃度共同作用于小鼠骨髓來(lái)源M0型巨噬細(xì)胞,孵育0-72h,Real-time PCR檢測(cè)M1相關(guān)細(xì)胞因子(i NOS、IL-6和TNF-α等)及M2相關(guān)細(xì)胞因子(Arg-1、IL-10、TGF-β)m RNA表達(dá)水平,ELISA檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-10、TGF-β1細(xì)胞因子分泌水平變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)F4/80、CD206、NOS2分子表達(dá)水平。6.RTR誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞極化的可能機(jī)制培養(yǎng)成熟的M0型巨噬細(xì)胞經(jīng)RTR、PA、Tern分別刺激24 h、48 h后,Western blot技術(shù)檢測(cè)M1/M2相關(guān)MAPK信號(hào)通路及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1.RTR刺激小鼠骨髓來(lái)源M0型巨噬細(xì)胞24h后,CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RTR誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞最佳濃度為100μg/m L;巨噬細(xì)胞鏡下觀:與圓形(或橢圓形)的M0型巨噬細(xì)胞向比,誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞兩端細(xì)長(zhǎng)中部寬大,且部分細(xì)胞出現(xiàn)偽足,與M1型巨噬細(xì)胞形態(tài)較為一致;Real-time PCR結(jié)果顯示:RTR刺激小鼠骨髓來(lái)源M0巨噬細(xì)胞從12h i NOS、IL-6和TNF-α高表達(dá),持續(xù)性低表達(dá)Arg-1、IL-10和TGF-β;ELISA結(jié)果顯示:RTR刺激12 h后TNF-α、i NOS分泌水平開(kāi)始升高,TGF-β分泌水平降低;FCM結(jié)果顯示:RTR刺激36h后巨噬細(xì)胞NOS2表面膜分子的表達(dá)水平開(kāi)始升高,CD206的表達(dá)水平降低;提示:RTR可誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源M0型巨噬細(xì)胞向M1型極化。2.高效液相等技術(shù)結(jié)果顯示,RTR全草中含量高于0.01%的單體化合物達(dá)50余種;結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,篩選出與炎癥相關(guān)化合物:棕櫚酸(PA)、小毛茛內(nèi)酯(Tern)、豆甾醇、2-脫氧-D-核糖酸-1,4-內(nèi)酯;Real-time PCR結(jié)果顯示:PA、Tern誘導(dǎo)后M1型相關(guān)細(xì)胞因子m RNA的相對(duì)表達(dá)水平較高,均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá);提示:PA和Tern可能參與RTR誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化過(guò)程。3.不同濃度的PA、Tern分別誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源M0型巨噬細(xì)胞24h,CCK8結(jié)果顯示:PA濃度不高于400μmol/L時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞活性無(wú)影響,Tern濃度不高于150mmol/L時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞活性無(wú)影響;形態(tài)學(xué)顯示:400μmol/L PA、150mg/L Tern誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形;分別以400μmol/L PA、150mg/L Tern誘導(dǎo)M0巨噬細(xì)胞0-72h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:M1型相關(guān)細(xì)胞因子m RNA的相對(duì)表達(dá)水平呈高表達(dá)狀態(tài)。ELISA結(jié)果顯示:PA誘導(dǎo)后,TNF-α、i NOS分泌水平較對(duì)照組升高,TGF-β分泌水平較對(duì)照組降低;FCM結(jié)果顯示:PA誘導(dǎo)組,巨噬細(xì)胞NOS2表面膜分子的表達(dá)水平升高,Tern誘導(dǎo)組,巨噬細(xì)胞CD86表面膜分子高表達(dá),CD206的表達(dá)水平降低;提示:PA/Tern可誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞M1型極化。4.根據(jù)PA/Tern成分比例,分別以9.5μmol/L PA和75mmol/L的Tern分別誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源M0型巨噬細(xì)胞0-72h,結(jié)果顯示:75mmol/L的Tern誘導(dǎo)組Realtime PCR發(fā)現(xiàn):抑炎性細(xì)胞因子(Arg-1、IL-10、TGF-β)呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài);促炎性細(xì)胞因子(i NOS、白介素-6和腫瘤壞死因子-α)表達(dá)較對(duì)照組明顯升高,FCM顯示:CD86呈高表達(dá)狀態(tài);CD206持續(xù)性低表達(dá);而PA誘導(dǎo)組無(wú)明顯變化;提示:RTR誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞M1型極化過(guò)程中,Tern起主導(dǎo)作用。5.以9.5μmol/L PA和75mmol/L Tern共同作用于小鼠骨髓來(lái)源M0型巨噬細(xì)胞0-72h,Real-time PCR檢測(cè)i NOS、IL-6和TNF-α高表達(dá);Arg-1、IL-10、TGF-β低表達(dá);FCM檢測(cè)結(jié)果顯示:NOS2高表達(dá);CD206低表達(dá);提示:RTR誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞M1型極化,可能是PA與Tern共同作用的結(jié)果。6.Western blot檢測(cè)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,RTR、PA、Tern分別誘導(dǎo)M0型小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞24 h、48 h后,NF-κB、p-p38-MAPK的表達(dá)明顯上調(diào)。且較PA、Tern誘導(dǎo)后的表達(dá)水平高表達(dá);提示:RTR誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞M1型極化可能與MAPK、NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。結(jié)論:1.貓爪草醇提取物可促進(jìn)小鼠骨髓來(lái)源M0型巨噬細(xì)胞向M1型極化。2.貓爪草醇類提取物中誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化的主要成分是棕櫚酸和小毛茛內(nèi)酯,且兩者發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)作用。3.貓爪草醇類提取物、棕櫚酸、小毛茛內(nèi)酯誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化可能與NF-κB/p38-MAPK信號(hào)通路相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2655061