發(fā)布時間：2020-05-08 06:25

【摘要】：研究目的龜甲(Testudinis Carapax et Plastrum)來源于龜科動物烏龜 Chinemys reevesii(Gray)的背甲及腹甲,藥用歷史悠久,常以龜甲飲片、醋制龜甲、龜甲膠等形式入藥,需求量大。龜甲膠(Testudinis Carapacis et Plastri Colla)由龜甲經(jīng)水煎煮、濃縮制成,是我國特有的補益類中藥之一。為了控制龜甲、龜甲膠摻假摻偽現(xiàn)象的發(fā)生,彌補龜甲、龜甲膠現(xiàn)有鑒別方法的不足,本實驗對龜甲及其混偽品的性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜鑒別進行了客觀系統(tǒng)的分析,并采用柱前衍生化HPLC法和電子鼻氣味識別技術分別對龜甲及其混偽品、市售龜甲、市售龜甲膠樣品的氨基酸種類、含量、比值和氣味等進行了分析和鑒別。該研究所得的氨基酸比值評價指標和電子鼻氣味判別模型適用于藥材碎片、粉末的鑒別,對龜甲、龜甲膠的質(zhì)量評價均有一定的指導意義,從而為龜甲、龜甲膠質(zhì)量評價體系的完善提供了參考。研究方法1樣品收集與性狀鑒別、顯微鑒別本研究共收集到12種龜類原動物,經(jīng)處理得到44批龜甲樣品,其中正品龜甲22批,龜甲混偽品22批。另外收集到市售龜甲19批和市售龜甲膠24批。對這些樣品進行性狀鑒別、顯微鑒別,將其特征進行描述并拍照記錄。2龜甲類樣品的薄層色譜鑒別按照2015年版《中國藥典》法,以膽固醇為對照品,對12種龜類甲殼的上下甲分別進行薄層色譜(TLC)鑒別,觀察其差異。同法,對市售龜甲進行TLC檢測。3建立龜甲、龜甲膠樣品中氨基酸的AQC柱前衍生化HPLC測定方法對樣品的水解時間、脫磷、脫鈣條件、氨基酸的含量計算等進行考察,確定最佳實驗條件。運用主成分分析(PCA)、聚類分析等多元統(tǒng)計方法,分別分析龜甲及其混偽品、市售龜甲、市售龜甲膠中不同氨基酸的含量或比值差異。4建立龜甲、龜甲膠的電子鼻判別模型分別對龜甲、龜甲膠樣品的稱樣量、進樣量、孵化溫度、孵化時間、粉碎粒度等5個因素進行單因素考察和正交試驗,確定龜甲、龜甲膠的最佳檢測條件。通過測試集和訓練集的驗證,建立龜甲的判別因子分析(DFA)模型,并用該模型對市售龜甲進行質(zhì)量評價。另外,運用DFA分析法對市售龜甲膠進行質(zhì)量評價。研究結果1正品龜甲與其它多數(shù)龜類樣品在性狀上區(qū)別明顯,主要表現(xiàn)在背甲和腹甲的顏色、盾片的特征等。市售龜甲膠性狀特征主要體現(xiàn)在顏色、質(zhì)地、斷面等,但差異較小。所有龜類樣品的顯微特征均有骨質(zhì)碎片和角質(zhì)碎片,區(qū)別較小,還不能將其準確用于龜類品種鑒別。2薄層鑒別結果顯示,在Rf值0.50左右,每份樣品均出現(xiàn)與對照品膽固醇顏色相同的斑點,說明該12種龜類樣品均含有膽固醇;此外,黃喉擬水龜?shù)纳舷录拙赗f值0.20左右,出現(xiàn)兩個藍色斑點,其它樣品僅出現(xiàn)一個斑點或不明顯,據(jù)此可將黃喉擬水龜甲鑒別出來。對市售龜甲藥材的TLC檢測發(fā)現(xiàn),其均出現(xiàn)與對照品顏色相同的斑點,且沒有黃喉擬水龜甲。3檢測樣品中氨基酸的前處理條件:O.1g的龜甲粉末需水解8h,70%乙醇20mL脫磷,0.1 mol·L-1的草酸8mL脫鈣;0.05g的龜甲膠需水解8h,70%乙醇20mL脫磷,0.1 mol·L-1的草酸6mL脫鈣。對氨基酸的種類和含量綜合分析發(fā)現(xiàn),龜甲的上、下甲中氨基酸的含量有差異,通過PCA分析法可將其區(qū)分開。除黃喉擬水龜外,根據(jù)正品龜甲甘氨酸(Gly)/脯氨酸(Pro)的比值范圍1.763～1.854和Gly/蘇氨酸(Thr)的比值范圍5.372～7.729可將其余混偽品鑒別開來;其鑒別率達90.91%。該法對市售龜甲樣品進行鑒別,正品龜甲占73.68%。市售龜甲膠樣品中羥脯氨酸(Hyp)、Gly、丙氨酸(Ala)、Pro的含量幾乎均符合2015版《中國藥典》規(guī)定;通過聚類分析可將市售龜甲膠主要分成兩大類,而Gly/精氨酸(Arg)的比值 2.78～2.88、Gly/Ala 比值 2.28～2.39、Gly/Pro 比值 1.84～1.90 中任一個與 Gly/Hyp的比值范圍2.62～2.85相結合,其鑒別結果與聚類結果一致,說明氨基酸比值法同樣適用于龜甲膠的質(zhì)量分析。4龜甲的最佳檢測條件為稱樣量0.3g、孵化溫度55℃、進樣量2000μL、粉碎粒度3號篩、孵化時間300s;龜甲膠的最佳檢測條件為稱樣量0.6g、進樣量2500μL、孵化溫度70℃、粉碎粒度3號篩、孵化時間1200s。通過測試集和訓練集的驗證,龜甲正品與混偽品建立的DFA判別模型判別效果較好。對龜甲膠樣品建立的擬正品組和擬偽品組建立的DFA判別模型同樣可將二者區(qū)分開。說明電子鼻氣味識別技術對龜甲及其混偽品、市售龜甲膠具有一定的判別能力。結論1采用薄層色譜法,可以鑒別出龜甲混偽品中的黃喉擬水龜甲。2 AQC柱前衍生化HPLC法能夠用于檢測龜甲、龜甲膠中的氨基酸種類和含量。氨基酸比值法,可以鑒別龜甲及其混偽品;可以初步評價市售龜甲膠的質(zhì)量。3電子鼻氣味識別技術能夠?qū)敿准捌浠靷纹返臍馕哆M行識別并初步評價龜甲膠藥材質(zhì)量。創(chuàng)新點首次采用AQC柱前衍生化HPLC法測定龜甲及其混偽品中16種氨基酸的含量。該方法所得衍生化樣品穩(wěn)定,檢測效率高。首次運用氨基酸比值法鑒別龜甲及其混偽品、龜甲膠樣品。氨基酸比值法與薄層色譜法相結合,能較好地鑒別出龜甲及其它11種混偽品。首次采用電子鼻氣味識別技術鑒別龜甲及其混偽品,該法能夠較好地鑒別開龜甲與其混偽品。
【圖文】：

逡逑灥國逡逑圖３－１龜上甲角質(zhì)碎片４０邐圖３－２龜下甲角質(zhì)碎片ｘ４０逡逑■邋■逡逑圖３－３龜上甲骨質(zhì)碎片ｘ４０邐圖３－４龜下甲骨質(zhì)碎片ｘ４０逡逑如圖，龜甲中角質(zhì)碎片（圖３－１、３－２）和骨碎片（圖３－３、３－４）。龜甲中角質(zhì)碎片逡逑不規(guī)則形，灰棕色或灰白色；表面有不整齊波狀紋理，斷面呈層片狀。骨碎片大小不一，逡逑表面有縱向或不規(guī)則細密紋理及細點狀孔隙；骨小管大多隱約。逡逑通過對龜甲及其混偽品的顯微特征進行觀察，發(fā)現(xiàn)不同品種龜甲樣品均存在角質(zhì)碎逡逑片和骨碎片。角質(zhì)碎片差異不明顯；骨碎片表面均存在多數(shù)不規(guī)則的孔隙，差異較小。逡逑４龜甲樣品的薄層色譜鑒別逡逑２０１５年版《中國藥典》中規(guī)定，龜甲的理化鑒別主要采用薄層法，本實驗依據(jù)此法，逡逑主要對１２種龜類的２６批樣品和１９批市售龜甲進行薄層色譜實驗，觀察其差異。逡逑４．１實驗儀器與試劑逡逑ＴＣＱ－２５０超聲波清洗機（北京醫(yī)療設備二廠）；ＨＨＳ－２１－６電熱

逡逑灥國逡逑圖３－１龜上甲角質(zhì)碎片４０邐圖３－２龜下甲角質(zhì)碎片ｘ４０逡逑■邋■逡逑圖３－３龜上甲骨質(zhì)碎片ｘ４０邐圖３－４龜下甲骨質(zhì)碎片ｘ４０逡逑如圖，龜甲中角質(zhì)碎片（圖３－１、３－２）和骨碎片（圖３－３、３－４）。龜甲中角質(zhì)碎片逡逑不規(guī)則形，灰棕色或灰白色；表面有不整齊波狀紋理，斷面呈層片狀。骨碎片大小不一，逡逑表面有縱向或不規(guī)則細密紋理及細點狀孔隙；骨小管大多隱約。逡逑通過對龜甲及其混偽品的顯微特征進行觀察，發(fā)現(xiàn)不同品種龜甲樣品均存在角質(zhì)碎逡逑片和骨碎片。角質(zhì)碎片差異不明顯；骨碎片表面均存在多數(shù)不規(guī)則的孔隙，，差異較小。逡逑４龜甲樣品的薄層色譜鑒別逡逑２０１５年版《中國藥典》中規(guī)定，龜甲的理化鑒別主要采用薄層法，本實驗依據(jù)此法，逡逑主要對１２種龜類的２６批樣品和１９批市售龜甲進行薄層色譜實驗，觀察其差異。逡逑４．１實驗儀器與試劑逡逑ＴＣＱ－２５０超聲波清洗機（北京醫(yī)療設備二廠）；ＨＨＳ－２１－６電熱
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R284.1

【參考文獻】

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本文編號：2654269