【摘要】：納豆激酶(nattokinase,NK)是由納豆枯草桿菌(Bacillus subtilis natto),在納豆發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的一種具有強(qiáng)烈纖溶作用的絲氨酸蛋白酶。研究表明納豆激酶不僅易于提取純化,成本低廉,溶栓效果好,藥效時(shí)間長(zhǎng),而且安全性好,為解決目前抗血栓類藥物的口服性差,價(jià)格昂貴、并發(fā)癥多等問(wèn)題帶來(lái)更多希望。本文通過(guò)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室分離到的高產(chǎn)納豆激酶菌株(Bacillus subtilis natto LNUB236)經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng),以發(fā)酵液為原料,采用硫酸銨沉淀納豆激酶,將離心后的沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解,得到的納豆激酶粗酶液,進(jìn)行兩次Sephadex G-75凝膠層析,收集到的納豆激酶活性組分經(jīng)過(guò)冷凍干燥得到凍干粉,并定量將凍干粉裝入大鼠專用腸溶膠囊,以口服納豆激酶腸溶膠囊的給藥方式來(lái)評(píng)價(jià)納豆激酶在體內(nèi)的藥效作用、體內(nèi)急性毒性和長(zhǎng)期毒性,為納豆激酶的臨床應(yīng)用和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。納豆激酶抗血栓的作用評(píng)價(jià)是通過(guò)構(gòu)建SD大鼠體內(nèi)血栓模型以及對(duì)小鼠尾部出血時(shí)間的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。體內(nèi)藥效表明,FeCl_3誘導(dǎo)的大鼠頸動(dòng)脈血栓實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,納豆激酶5000 IU/kg、10000 IU/kg、15000 IU/kg劑量組均能夠有效抑制大鼠頸動(dòng)脈血栓的形成(P0.0001),且具有劑量依賴性。在小鼠尾部出血實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,5000 IU/kg、10000 IU/kg、15000 IU/kg劑量組均能顯著延長(zhǎng)出血時(shí)間(P0.0001),且隨著給藥劑量的增加出血時(shí)間更長(zhǎng)(P0.0001),具有劑量依賴性。觀察納豆激酶對(duì)SD大鼠的急性毒性和長(zhǎng)期毒性,為臨床用藥安全提供參考。納豆激酶急性毒性實(shí)驗(yàn)中,一次給藥5000 mg/kg,并連續(xù)觀察14天,記錄毒性反應(yīng)和死亡情況。急性毒性實(shí)驗(yàn)中無(wú)毒性反應(yīng)和死亡發(fā)生,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明納豆激酶的LD_(50)5000 mg/kg,無(wú)急性中毒的危險(xiǎn)性。在長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)中,觀察大鼠重復(fù)28天給予納豆激酶毒性反應(yīng),將大鼠隨機(jī)分成4組,分別為對(duì)照組、納豆激酶120 mg/kg、360 mg/kg、1000 mg/kg給藥劑量組,重復(fù)給藥28天,試驗(yàn)期間每天觀察大鼠的外觀體征、行為活動(dòng),并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束采集血樣進(jìn)行血液學(xué)、血液生化學(xué)、凝血指標(biāo)及病理組織學(xué)檢查。納豆激酶重復(fù)給藥28天,給藥期間大鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好,行為活動(dòng)正常,各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)均未發(fā)現(xiàn)異常,本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)與納豆激酶毒性相關(guān)的異常改變,納豆激酶經(jīng)口服給藥28天對(duì)大鼠無(wú)明顯毒性。納豆激酶重復(fù)給藥90天的毒性實(shí)驗(yàn)中,大鼠隨機(jī)分為4組,分別為對(duì)照組、納豆激酶120mg/kg、360 mg/kg、1000 mg/kg給藥劑量組,重復(fù)給藥90天,給藥期間觀察大鼠的一般狀態(tài),給藥結(jié)束后大鼠分別進(jìn)行血液學(xué)、血液生化學(xué)、凝血指標(biāo)和病理組織檢查。實(shí)驗(yàn)期間各給藥組大鼠的外觀體征,行為活動(dòng),糞便等均正常,各項(xiàng)指標(biāo)檢查均未發(fā)現(xiàn)異常。本實(shí)驗(yàn)條件下,未發(fā)現(xiàn)納豆激酶毒性引起的異常改變,納豆激酶經(jīng)口給藥90天對(duì)大鼠無(wú)明顯毒性。
【圖文】：

第 1 章 納豆激酶的制備 實(shí)驗(yàn)結(jié)果.1 酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制納豆激酶活性是折算成尿激酶的活性單位表示的，以尿激酶活性為橫坐標(biāo)，蛋白平板溶解圈面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)得到的尿激性和溶解圈直徑乘積的對(duì)數(shù)如表 1-2所示。表 1-2 酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線激酶酶活(IU/mL) 20 40 60 80 100 160 320徑乘積的對(duì)數(shù) 2.13 2.18 2.17 2.22 2.23 2.32 2.52以尿激酶活性為橫坐標(biāo)，，溶解圈直徑乘積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制酶活標(biāo)準(zhǔn)曲如圖 1-1 所示。

一次Sephadex-G-75凝膠層析圖譜
【學(xué)位授予單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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