【摘要】：目的從PD-1/PD-L1信號(hào)通路出發(fā),通過實(shí)驗(yàn)研究,采用H22肝癌細(xì)胞株傳代培養(yǎng)移植法構(gòu)建荷瘤小鼠模型,檢測藥物干預(yù)后荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長速度、荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞凋亡比例、荷瘤小鼠腫瘤周圍浸潤細(xì)胞PD-1表達(dá)陽性比例;以TGF-β1-si RNA抑制PD-1信號(hào)通路為對照,體外觀察龜鹿二仙膠對小鼠T淋巴細(xì)胞株CTLL-2中PD-1的m RNA及蛋白表達(dá)水平的影響。探討龜鹿二仙膠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞免疫的分子機(jī)制,分析其對順鉑引起的T細(xì)胞損傷是否有保護(hù)作用,為中醫(yī)藥輔助治療惡性腫瘤提供科學(xué)依據(jù)。方法1構(gòu)建模型及細(xì)胞懸液:采用H22肝癌細(xì)胞株傳代培養(yǎng)移植法構(gòu)建小鼠體內(nèi)移植瘤模型,常規(guī)培養(yǎng)傳代H22肝癌細(xì)胞株,接種SPF級(jí)BALB/c腹腔,6d后處死小鼠,無菌取腹水,用PBS稀釋成腫瘤細(xì)胞懸液,離心收集細(xì)胞,皮下接種于腋下,構(gòu)建小鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型;CTLL-2細(xì)胞用含10%胎牛血清,100U/ml的IL-2,1%雙抗(青鏈霉素混合液)的RMPI-1640培養(yǎng)液,置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞為懸浮細(xì)胞。2分組給藥:2.1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組給藥:將荷瘤小鼠隨機(jī)分為順鉑組、龜鹿二仙膠高劑量組、龜鹿二仙膠中劑量組、龜鹿二仙膠低劑量組、生理鹽水組,每組3只:(1)順鉑組(化療對照組):腹腔注射順鉑,每只3mg/kg,灌胃生理鹽水,每只0.3ml;(2)龜鹿二仙膠高劑量組:腹腔注射生理鹽水,每只0.2ml,灌胃龜鹿二仙膠0.38g;(3)龜鹿二仙膠中劑量組:腹腔注射生理鹽水,每只0.2ml,灌胃龜鹿二仙膠0.19g;(4)龜鹿二仙膠低劑量組:腹腔注射生理鹽水,每只0.2ml,灌胃龜鹿二仙膠0.095g;(5)生理鹽水組(陰性對照):腹腔注射生理鹽水,每只0.2 ml,灌胃生理鹽水,每只0.3 ml;(全部10天后開始給藥治療,連續(xù)給藥9天)。2.2體外實(shí)驗(yàn)分組給藥:在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入H22肝癌細(xì)胞,24h后每孔在加入5×106個(gè)CTLL-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染TGF-β1-si RNA后的CTLL-2懸液。分為龜鹿二仙膠組+TGF-β1-si RNA組、龜鹿二仙膠組、順鉑+TGF-β1-si RNA組、順鉑+龜鹿二仙膠+TGF-β1-si RNA組、順鉑+龜鹿二仙膠組、順鉑組、細(xì)胞對照+TGF-β1-si RNA組、空白對照組:(1)順鉑+龜鹿二仙膠組:用含10uM順鉑和6%龜鹿二仙膠大鼠血清(補(bǔ)4%胎牛血清)的培養(yǎng)基處理細(xì)胞;(2)順鉑+龜鹿二仙膠+TGF-β1-siRNA組:轉(zhuǎn)染TGF-β1-siRNA,24h后用含10uM順鉑和6%龜鹿二仙膠大鼠血清(補(bǔ)4%胎牛血清)的培養(yǎng)基處理細(xì)胞;(3)順鉑組:用含10u M順鉑的培養(yǎng)基處理細(xì)胞;(4)順鉑+TGF-β1-siRNA組:轉(zhuǎn)染TGF-β1-siRNA,24h后用含10uM順鉑的培養(yǎng)基處理細(xì)胞;(5)龜鹿二仙膠組:用含有6%龜鹿二仙膠大鼠血清(補(bǔ)4%胎牛血清)的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞;(6)龜鹿二仙膠+TGF-β1-siRNA組:轉(zhuǎn)染TGF-β1-siRNA,24h后用含6%龜鹿二仙膠大鼠血清(補(bǔ)4%胎牛血清)的培養(yǎng)基處理細(xì)胞;(7)細(xì)胞對照+TGF-β1-siRNA組:轉(zhuǎn)染TGF-β1-siRNA;(8)細(xì)胞對照組:只加完全培養(yǎng)基;37℃培養(yǎng)2d后進(jìn)行相關(guān)檢測。2.3檢測指標(biāo)2.3.1荷瘤小鼠瘤重檢測:分別在給藥后第1,4,7,10,13,16,19天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小。待瘤19天長大后將小鼠處死,拍照,取出瘤子進(jìn)行稱重、記錄保存,同時(shí)取出脾臟立即分離淋巴細(xì)胞用于流式檢測。2.3.2荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞凋亡比例檢測:先收集荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞再行流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞凋亡及腫瘤浸潤性T細(xì)胞PD-1+比例;2.3.3體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞PD-1 m RNA和蛋白表達(dá)檢測:Real-Time PCR技術(shù)檢測體外共培養(yǎng)體系中的CTLL-2細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)后PD-1 m RNA的表達(dá);Western Blot法檢測PD-1的表達(dá)影響。3結(jié)果3.1 14天后與生理鹽水對照組相比,順鉑組、龜鹿二仙膠高劑量組、龜鹿二仙膠中劑量組在均有明顯抑制瘤體生長的作用(P0.05),且高劑量組的抑制瘤作用較低劑量組明顯P0.05)。3.2龜鹿二仙膠高、中、低劑量組的早期T淋巴凋亡比明顯低于順鉑組和生理鹽水(陰性對照)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中龜鹿二仙膠中、高劑量組較低劑量組具有更明顯的降低早期T淋巴細(xì)胞凋亡的作用(P0.05);而在龜鹿二仙膠中、高劑量組之間作用無明顯差異(P0.05);龜鹿二仙膠高劑量組的晚期凋亡細(xì)胞比明顯低于順鉑組及生理鹽水(陰性對照)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.3龜鹿二仙膠高劑量組、龜鹿二仙膠中劑量組的PD-1表達(dá)陽性細(xì)胞比明顯低于與順鉑組和生理鹽水組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.4與細(xì)胞對照組相比順鉑不影響CTLL-2細(xì)胞中PD-1陽性細(xì)胞比例(P0.05)但能夠顯著促進(jìn)其凋亡(P0.05),龜鹿二仙膠能夠顯著抑制CTLL-2細(xì)胞凋亡降低PD-1陽性細(xì)胞比例(P0.05);龜鹿二仙膠+順鉑組較順鉑組相比細(xì)胞凋亡水平有所下降;龜鹿二仙膠和TGF-β1-si RNA均能降低T細(xì)胞PD-1 m RNA表達(dá)水平,且聯(lián)合使用效果更明顯,但其中是否具有協(xié)同作用尚不明確。3.5與細(xì)胞對照組比較,龜鹿二仙膠組、順鉑+龜鹿二仙膠組、順鉑+TGF-β1-si RNA組、龜鹿二仙膠+TGF-β1-si RNA組、細(xì)胞對照+TGF-β1-si RNA組PD-1表達(dá)水平均下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),順鉑組對PD-1的表達(dá)影響不明顯;龜鹿二仙膠+TGF-β1-si RNA組的降低PD-1蛋白表達(dá)作用比細(xì)胞對照+TGF-β1-si RNA組更顯著(P0.05)。順鉑能夠引起CTLL-2的凋亡,而龜鹿二仙膠能夠抑制順鉑誘導(dǎo)CTLL-2細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。4結(jié)論4.1龜鹿二仙膠可以通過抑制T細(xì)胞凋亡,降低腫瘤周圍T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)的比例,從而提高細(xì)胞免疫力,抑制腫瘤生長,改善荷瘤小鼠的免疫功能,達(dá)到抗腫瘤的目的;4.2龜鹿二仙膠不僅能夠降低腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的T細(xì)胞PD-1表達(dá)水平上調(diào),同時(shí)還能夠抑制順鉑誘導(dǎo)的CTLL-2細(xì)胞凋亡,從而減少化療引起的免疫抑制,保護(hù)患者細(xì)胞免疫,有利于治療腫瘤。
【圖文】：

鹿二仙湯治療乳腺惡性腫瘤患者，服藥 5 天后白細(xì)胞升至正常水平者 41 例效 7 例，無效 2 例，總有效率 98%。師林等[27]將 75 例晚期 NSCLC 患為對照組（GP 化療組）和治療組（GP 化療方案加龜鹿二仙膠湯組），經(jīng)療程的治療后，治療組 CD4+、CD4+/CD8+ 比值、NK 細(xì)胞活性治療后均高于治療前（P<0.05）；治療組 G-CSF 使用率少于對照組（P<0.01）。我期的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明[33]：龜鹿二仙膠能夠抑制化療小鼠脾臟 T 淋巴細(xì)凋亡，對腫瘤治療后的免疫功能具有保護(hù)作用。但其內(nèi)在機(jī)制目前尚不明確 小結(jié)在中醫(yī)學(xué)“整體局部辨證統(tǒng)一”理論指導(dǎo)下，結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)中藥對機(jī)體免疫影理論基礎(chǔ)，通過實(shí)驗(yàn)研究，探討中藥復(fù)方龜鹿二仙膠對惡性腫瘤生長及化療疫功能抑制的下調(diào)作用，，揭示龜鹿二仙膠可能通過影響免疫功能從而達(dá)到抗的目的，為龜鹿二仙膠在惡性腫瘤治療中的推廣運(yùn)用提供理論依據(jù)。

順鉑各劑量與腫瘤細(xì)胞抑制率之間的關(guān)系圖
【學(xué)位授予單位】：浙江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2653194