【摘要】：目的:本文以三七和黃連提取物為載體,以三七中的人參皂苷Rg_1、人參皂苷Rb_1和黃連中的小檗堿、黃連堿為研究對(duì)象,分別從體外腸道菌群代謝和大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)兩個(gè)方面進(jìn)行研究,闡明三七和黃連提取物與腸道菌群的相互作用關(guān)系。方法:1.運(yùn)用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法(HPLC-UV)建立三七中皂苷類成分和黃連中生物堿類成分在腸菌液中的分析方法;2.采用離體糞便溫孵法,分別將三七提取物、黃連提取物以單用和聯(lián)用的方式與健康人類,正常大鼠和偽無菌大鼠的糞菌液在體外37℃厭氧環(huán)境下共同培養(yǎng),分析比較各組分在24 h之內(nèi)經(jīng)腸道菌群代謝作用的含量變化及趨勢(shì);3.運(yùn)用超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)建立血漿樣品中4個(gè)組分的含量測(cè)定方法;4.用混合抗生素建立偽無菌大鼠模型,將三七和黃連提取物以單用和聯(lián)用的方式分別灌胃給予正常大鼠和偽無菌大鼠,比較在兩種大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果:1.用HPLC-UV建立皂苷類成分和生物堿類的成分在糞菌液中的分析方法,其專屬性、線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性和回收率均良好。2.人參皂苷Rg_1在健康人和正常大鼠的糞菌液代謝中,三七組和三七+黃連組均表現(xiàn)為4 h內(nèi)很穩(wěn)定,之后含量逐漸下降,24 h后仍能被檢測(cè)到,與三七組相比,三七+黃連組含量下降趨勢(shì)明顯減緩;在偽無菌大鼠的糞便孵育液中的三七組和三七+黃連組含量下降趨勢(shì)無顯著性差異;與正常大鼠的糞菌液中三七組比較,人的糞菌液中三七組含量下降較快;與正常大鼠的糞菌液中三七組比較,偽無菌大鼠菌液中三七組含量下降趨勢(shì)減緩。3.人參皂苷Rb_1在健康人和正常大鼠的糞菌液代謝中,三七組含量在24 h內(nèi)隨著時(shí)間逐漸下降接近為零,在2 h內(nèi)均迅速降低,但三七+黃連組含量下降趨勢(shì)減緩,尤其在2 h內(nèi)含量下降明顯減慢;在偽無菌大鼠的糞便孵育液中的三七組和三七+黃連組均沒有完全代謝,24 h后含量下降至50%左右,且兩組之間的下降趨勢(shì)無明顯差異。4.小檗堿和黃連堿在人、正常大鼠、偽無菌大鼠的糞菌液中黃連組和三七+黃連組的含量下降均不明顯。5.用UPLC-MS/MS建立皂苷類成分和生物堿類的成分在血漿樣品中的分析方法,其專屬性、線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性和回收率均良好。6.正常大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示,與三七組比較,三七+黃連組的人參皂苷Rg_1、人參皂苷Rb_1在體內(nèi)血藥濃度較高,達(dá)峰時(shí)間T_(max)均提前,吸收程度增加,半衰期T_(1/2)、達(dá)峰濃度C_(max)和藥時(shí)曲線下面積AUC_((0-∞))均增加,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與黃連組比較,三七+黃連組的小檗堿和黃連堿T_(max)略提前,吸收速率略快,C_(max)、AUC_((0-∞))略增加,但均無顯著性差異。7.偽無菌大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示,其黃連組和三七+黃連組之間無顯著性差異;與正常大鼠三七組比較,偽無菌三七組的人參皂苷Rg_1、人參皂苷Rb_1的達(dá)峰時(shí)間T_(max)減少,半衰期T_(1/2)、達(dá)峰濃度C_(max)和藥時(shí)曲線下面積AUC_((0-∞))均增加,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與正常大鼠黃連組比較,偽無菌黃連組的小檗堿和黃連堿達(dá)峰時(shí)間T_(max)增加、半衰期T_(1/2)、達(dá)峰濃度C_(max)和藥時(shí)曲線下面積AUC_((0-∞))均減少,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:1.腸道菌群對(duì)三七皂苷類成分代謝作用明顯,對(duì)黃連生物堿代謝不明顯。2.三七在人,正常大鼠的腸道菌群代謝中具有差異性,其中人的腸道菌群代謝皂苷類成分能力最強(qiáng)。3.三七與黃連聯(lián)用可有效抑制三七皂苷類成分的代謝作用,但對(duì)黃連生物堿類成分無明顯作用。4.三七與黃連聯(lián)用在大鼠體內(nèi)可促進(jìn)三七皂苷類成分的吸收并提高其生物利用度,但對(duì)黃連生物堿成分無明顯作用。5.抑制腸道菌群可有效提高三七皂苷類的吸收和生物利用度,但降低黃連生物堿類的吸收和生物利用度,使得在偽無菌大鼠體內(nèi)單用和聯(lián)用無顯著性差異。6.三七與黃連聯(lián)用的化學(xué)效應(yīng)機(jī)制與β-葡萄糖苷酶有關(guān)。運(yùn)用HPLC-UV和UPLC-MS/MS技術(shù)建立分析方法,分別應(yīng)用于腸菌液中及血漿樣品中測(cè)定三七和黃連提取物主要成分的含量,該方法準(zhǔn)確可靠,便于操作。初步研究在三七和黃連提取物單用與聯(lián)用時(shí),基于腸道菌群的體外代謝研究,揭示四種有效成分在體外腸道菌群中的代謝規(guī)律以及二者聯(lián)用可有效抑制腸道菌群對(duì)三七皂苷類成分的代謝作用;大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究揭示了三七與黃連聯(lián)用可顯著提高三七皂苷類成分的生物利用度,并與腸道菌群中的糖苷酶的活性密切相關(guān),為中藥復(fù)方田黃片的臨床用藥提供依據(jù),也為進(jìn)一步研制高效制劑、提高中藥生物利用度提供理論參考。
【圖文】：

分別從人、正常大鼠、偽無菌大鼠取適量新鮮糞便與無菌生理鹽水按比例 l:5(g/m混合，玻璃棒攪勻，經(jīng)過三層紗布過濾所得濾液即為相應(yīng)的腸道菌液。取適量腸道菌群與厭氧培養(yǎng)基按 l:9(v/v)的比例混合，搖勻后即得到相應(yīng)的腸菌孵育液[71]。將腸菌孵育液分成兩份，一份用于離體代謝試驗(yàn)，另一份需在在 0.07 MPa、115℃條件下滅菌20 min，得到空白腸菌孵育液用作方法學(xué)的驗(yàn)證。2.2.1.5 生物樣品的前處理向 300 μL 的腸菌液和藥液共同孵育體系中加入 1.5 mL 的水飽和正丁醇：乙酸乙酯（3：1）的萃取液，渦旋 3 min，再以 4℃，12000 rpm/min 離心 10 min。取上清 1mL 揮干，用初始流動(dòng)相 240 μL 復(fù)溶，渦旋 3 min，再以 4℃，15000 rpm/min 離心，取上清液上樣，，供 HPLC 分析。2.2.1.6 方法學(xué)驗(yàn)證(1) 方法的專屬性考察按“2.2.1.1”項(xiàng)下，記錄空白腸菌孵育液、空白腸菌孵育液+人參皂苷 Rg1+人參皂苷 Rb1和空白腸菌液+三七提取物的色譜圖，結(jié)果見圖 2-1 顯示：兩個(gè)組分可完全分離，且空白腸菌孵育液中的其他組分不產(chǎn)生干擾，說明方法專屬性較好。

圖 2-2 考察專屬性注：空白腸菌孵育液（a）、空白腸菌孵育液+小檗堿+黃連堿混合對(duì)照品（b）空白腸菌孵育液黃連提取物（c）的 HPLC 色譜圖，1 黃連堿；2 小檗堿按“2.2.2.1”項(xiàng)下，記錄空白腸菌孵育液、空白腸菌孵育液+小檗堿+黃連堿以及空白腸菌孵育液+黃連提取物的色譜圖，結(jié)果見圖 2-2 顯示：兩個(gè)組分可完全分離，且空白腸菌孵育液中的其他組分不產(chǎn)生干擾，說明方法專屬性較好。(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察表 2-13 小檗堿、黃連堿在各菌液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線成分 人菌液 正常大鼠菌液 偽無菌大鼠菌液小檗堿 y = 8797.9x  3950.8R2 = 0.9992y = 12496x  33850.5R2 = 0.9999y =9846x  5350.5R2 = 0.9997黃連堿 y = 22326x - 3656.2R2 = 0.9999y = 17665x - 571206R2 = 0.9999y = 23934x  8481.8R2 = 0.9999
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2653037