【摘要】：第一部分基于AD細胞模型的通絡(luò)醒腦泡騰片活性成分篩選研究目的:采用H_2O_2和Aβ_(25-35)誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞損傷構(gòu)建擬AD細胞模型,篩選確定通絡(luò)醒腦泡騰片中具有神經(jīng)細胞保護作用的活性成分,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。方法:選用SH-SY5Y細胞為研究對象,參考文獻給予50、100、150、200、400、500、600、800uM的H_2O_2損傷細胞2h、8h、12h和24h,采用MTT法測定H_2O_2對細胞活性的影響,確定H_2O_2誘導(dǎo)細胞損傷的最佳濃度和時間;給予5uM、10uM、30uM、60uM、100uM寡聚體Aβ_(25-35)損傷細胞24h和48h后,采用MTT法測定Aβ_(25-35)對細胞活性的影響,確定Aβ_(25-35)誘導(dǎo)細胞損傷的最佳濃度和時間;給予通絡(luò)醒腦泡騰片成分及其它來源的活性成分(12.5、25、50uM)預(yù)處理細胞24h,以500uM H_2O_2(IC_(50))作用細胞2h或20uM Aβ_(25-35)(IC_(50))作用細胞24h后,采用MTT法測定細胞活性,并經(jīng)過多次盲法重復(fù)篩選驗證,確定通絡(luò)醒腦泡騰片中對H_2O_2或Aβ_(25-35)損傷細胞模型具有保護作用的活性成分,用于后續(xù)研究。結(jié)果:采用H_2O_2損傷SH-SY5Y細胞,H_2O_2呈劑量依賴性降低細胞活性,H_2O_2作用細胞2h的IC_(50)為500uM;經(jīng)3次盲法篩選發(fā)現(xiàn),GHX-13、P-15、GHC-6對H_2O_2損傷細胞模型的保護作用明確且穩(wěn)定性較好;采用寡聚體Aβ_(25-35)損傷SH-SY5Y細胞,Aβ_(25-35)呈時間和劑量依賴性降低細胞活性,Aβ_(25-35)作用細胞24h的IC_(50)為20uM。經(jīng)過3次盲法重復(fù)篩選發(fā)現(xiàn),P-15、GHC-6對Aβ_(25-35)損傷細胞模型的保護作用明確且穩(wěn)定性較好。通過對比化合物來源和揭盲發(fā)現(xiàn),其中P-15來源于通絡(luò)醒腦泡騰片成分,因此確定P-15為通絡(luò)醒腦泡騰片活性成分,用于后續(xù)研究。結(jié)論:通過多次盲法重復(fù)篩選發(fā)現(xiàn),源于通絡(luò)醒腦泡騰片的活性成分P-15對H_2O_2和Aβ_(25-35)損傷的SH-SY5Y細胞保護作用明確,且重現(xiàn)性高和穩(wěn)定性好,故后續(xù)研究將以P-15為研究對象進行。第二部分P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)SH-SY5Y擬AD細胞模型自噬-溶酶體途徑的調(diào)控作用及機制研究目的:基于Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷模型再次驗證P-15的神經(jīng)保護作用,并考察P-15對該細胞模型自噬-溶酶體途徑的調(diào)控作用和對mTOR/TFEB通路的影響,揭示P-15通過自噬-溶酶體途徑調(diào)控抗AD的分子機制。方法:1.自噬流阻滯參與Aβ_(25-35)介導(dǎo)的自噬泡的異常堆積的研究1.1 Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷的自噬泡水平的時間變化規(guī)律研究以20uM Aβ_(25-35)作用SH-SY5Y細胞0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48h,MDC染色法檢測自噬泡水平,Western Blot法檢測LC3-II/I比值和P62/SQSTM1蛋白水平的表達水平。1.2 Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的自噬泡異常堆積與自噬的過度激活的相關(guān)性研究以6.25~100uM預(yù)處理細胞細胞2h后,各組細胞給予20uM Aβ_(25-35)或培養(yǎng)基作用細胞24h,采用MTT法測定細胞活性,確定CQ的最大無毒濃度和CQ對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的細胞活性下降的影響。將細胞設(shè)置為4組:(1)正常組(不作任何處理),(2)CQ組(25uM CQ預(yù)處理2h),(3)Aβ_(25-35)組(20uM),(3)Aβ_(25-35)+CQ組(25uM CQ預(yù)處理2h),Aβ_(25-35)作用24h后,Western Blot法檢測LC3-II/I比值。2.P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷的保護及對自噬-溶酶體途徑的調(diào)控作用2.1 P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用研究以3.125~400uM P-15分別處理細胞24h和48h,采用MTT法測定細胞活性,確定P-15的最大無毒濃度。將細胞設(shè)置為(1)正常組(不作處理),(2)Aβ_(25-35)(20uM Aβ_(25-35)),(3)P-15組(20uM Aβ_(25-35)+3.125~50uM P-15),(4)調(diào)零孔(不接種細胞),P-15預(yù)處理細胞24h和48h后,給予20uM Aβ_(25-35)損傷24h,采用MTT法檢測P-15對細胞活性的影響,確定P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的細胞損傷的保護作用的最佳時間和濃度范圍;采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),觀察P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的細胞損傷的細胞形態(tài)的影響。2.2 P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的自噬泡聚集的影響將細胞設(shè)置為(1)正常組(不作處理),(2)Aβ_(25-35)(20uM Aβ_(25-35)),(3)P-15組(20uM Aβ_(25-35)+6.25~50uM P-15),各組細胞處理3,6,12,24,48h后,檢測MDC的平均熒光強度。2.3 P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷的溶酶體功能的影響將細胞設(shè)置為(1)正常組(不作處理),(2)Aβ_(25-35)(20uM Aβ_(25-35)),(3)P-15組(20uM Aβ_(25-35)+6.25~50uM P-15),P-15預(yù)處理細胞24h后,給予20uM Aβ_(25-35)損傷24h,Western Blot法檢測Cathepsin D的蛋白水平;設(shè)置(1)空白對照組(不作任何處理),(2)EBSS對照組(EBSS,處理30min),(3)CQ對照組(25uM CQ,處理2h),(4)Aβ_(25-35)(20uM Aβ_(25-35)),(5)P-15組(50uM P-15+20uM Aβ_(25-35)),P-15預(yù)處理細胞24h后,給予20uM Aβ_(25-35)損傷24h,Lyso-Tracker熒光探針法檢測溶酶體數(shù)目及Lyso-Tracker平均熒光強度;2.4 P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷的自噬流的影響將細胞設(shè)置為(1)正常組(不作處理),(2)Aβ_(25-35)(20uM Aβ_(25-35)),(3)P-15組(20uM Aβ_(25-35)+6.25~50uM P-15),P-15預(yù)處理細胞24h后,給予20uM Aβ_(25-35)損傷24h,Western Blot法檢測LC3-II/I比值和P62/SQSTM1的蛋白水平;以mCherry-GFP-LC3腺病毒(MOI=2)轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞,將轉(zhuǎn)染成功后的細胞分為(1)正常組(不作任何處理),(2)模型組(20uM Aβ_(25-35)),(3)P-15組(50uM P-15+20uM Aβ_(25-35)),P-15預(yù)處理細胞24h后,給予20uM Aβ_(25-35)損傷24h,激光共聚焦顯微鏡下觀察P-15對自噬流的影響。3.CQ對P-15提高Aβ_(25-35)誘導(dǎo)下降的細胞活性的作用的影響將細胞設(shè)置為(1)正常組(不作任何處理),(2)CQ組(25uM CQ預(yù)處理2h),(3)Aβ_(25-35)組,(4)P-15+Aβ_(25-35)組,(5)P-15+Aβ_(25-35)組+CQ組(25uM CQ預(yù)處理2h),P-15預(yù)處理細胞24h后,給予20uM Aβ_(25-35)損傷24h,采用MTT法測定細胞活性。4.P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷模型的mTOR/TFEB通路的影響。將細胞設(shè)置為(1)正常組(不作處理),(2)Aβ_(25-35)(20uM Aβ_(25-35)),(3)P-15組(20uM Aβ_(25-35)+6.25~50uM P-15),P-15預(yù)處理細胞24h后,給予20uM Aβ_(25-35)損傷24h,Western Blot法檢測TFEB總蛋白水平、TFEB核蛋白水平及p-mTOR/mTOR的比值。實驗結(jié)果:1.自噬流阻滯參與Aβ_(25-35)介導(dǎo)的自噬泡的異常堆積的研究1.1 Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷模型的自噬泡的時間變化規(guī)律研究20uM Aβ_(25-35)呈時間依賴性增強細胞中的MDC平均熒光強度(p0.05或p0.01),增加LC3-II/I比值(p0.05或0.01)和P62/SQSTM1的蛋白水平(p0.05或p0.01),提示Aβ_(25-35)呈時間依耐性介導(dǎo)細胞胞質(zhì)內(nèi)自噬泡聚集和自噬流阻滯。1.2 Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的自噬泡異常堆積是否與自噬的過度激活的相關(guān)性研究6.25~25uM CQ對正常組的細胞活性沒有明顯影響(p0.05),而在該劑量范圍內(nèi)CQ呈劑量依賴性協(xié)同Aβ_(25-35)誘導(dǎo)細胞活性下降(p0.05或p0.01)。與正常組比較,25uM CQ預(yù)處理細胞2h或Aβ_(25-35)作用細胞24h,可顯著上調(diào)LC3-II/I比值(p0.01);與Aβ_(25-35)組比較,Aβ_(25-35)+CQ組的LC3-II/I比值沒有明顯差異(p0.05),提示Aβ_(25-35)介導(dǎo)的自噬體異常聚集與自噬過度激活無關(guān)。2.P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷的保護及對自噬-溶酶體途徑的調(diào)控作用2.1 P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用P-15的給藥濃度在3.125~50uM區(qū)間內(nèi)作用細胞24h和48h,對SH-SY5Y細胞活性無影響(p0.05),當(dāng)給藥濃度達100~400uM時,細胞活性明顯下降(p0.01);P-15給藥濃度在6.25~50uM區(qū)間內(nèi),對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的細胞活性損傷有顯著的保護作用(p0.05或p0.01),能顯著拮抗細胞胞體皺縮、細胞膜破裂、細胞間隙變大、胞質(zhì)內(nèi)顆粒物沉積和空泡樣結(jié)構(gòu)增多等細胞形態(tài)改變。2.2 P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的自噬泡聚集的影響與空白組比較,Aβ_(25-35)呈時間依賴性增加MDC的平均熒光強度(p0.05或p0.01);與Aβ_(25-35)組比較,P-15作用12h和24h能明顯下調(diào)MDC平均熒光強度(p0.05或p0.01),提示P-15能顯著緩解Aβ_(25-35)介導(dǎo)的自噬體異常聚集。2.3 P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷的溶酶體功能的影響與空白組比較,Aβ_(25-35)組的平均熒光強度和Cathepsin D蛋白水平降低(p0.05或p0.01);與Aβ_(25-35)組比較,P-15可以明顯恢復(fù)Aβ_(25-35)誘導(dǎo)下降的LysoTracker的平均熒光強度(p0.05),明顯上調(diào)Cathepsin D蛋白水平(p0.05或p0.01);提示P-15對溶酶體功能具有上調(diào)作用。2.4 P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷的自噬流的影響與空白組比較,Aβ_(25-35)組的LC3-II/I比值和P62/SQSTM1蛋白表達水平顯著升高(p0.01)。與Aβ_(25-35)組比較,P-15能明顯降低LC3-II/I比值和P62/SQSTM1蛋白表達水平(p0.05或p0.01);以mCherry-GFP-LC3腺病毒成功轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞,與Aβ_(25-35)組比較,P-15可明顯降低黃色斑點數(shù)目,增加紅色斑點數(shù),提示P-15可促進自噬流。3.CQ對P-15提高Aβ_(25-35)誘導(dǎo)下降的細胞活性的作用的影響與空白組比較,Aβ_(25-35)能顯著誘導(dǎo)細胞活性下降(p0.01);與P-15+Aβ_(25-35)組比較,CQ預(yù)處理2h阻斷溶酶體后,P-15提高細胞活性的作用減弱(p0.05),提示P-15提高Aβ_(25-35)誘導(dǎo)下降的細胞活性與上調(diào)溶酶體功能相關(guān)。4.P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞損傷模型的mTOR/TFEB通路的影響。與空白組比較,Aβ_(25-35)對總細胞中TFEB水平?jīng)]有顯著影響(p0.05),但能顯著減少細胞核的TFEB蛋白水平(p0.05或p0.01),增加p-mTOR/mTOR比值(p0.01);與Aβ_(25-35)組細胞比較,P-15對總細胞中TFEB水平?jīng)]有顯著影響(p0.05),但能顯著增加細胞核的TFEB蛋白水平(p0.05或p0.01),降低p-mTOR/mTOR比值(p0.05或p0.01)。結(jié)論:20uM Aβ_(25-35)作用SH-SY5Y細胞可呈時間依耐性誘導(dǎo)細胞胞質(zhì)內(nèi)自噬泡的異常聚集。Aβ_(25-35)介導(dǎo)的細胞胞質(zhì)內(nèi)自噬泡的異常堆積,與自噬體過度形成無關(guān),與自噬流阻滯相關(guān)。P-15對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的細胞損傷有明顯的保護作用,其有效濃度為6.25~50uM,其通過抑制mTOR/TFEB信號通路恢復(fù)溶酶體功能,促進自噬流以介導(dǎo)自噬泡的清除,發(fā)揮對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用。第三部分P-15對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及調(diào)控自噬-溶酶體途的驗證研究目的:考察P-15對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能、海馬CA1區(qū)病理形態(tài)、海馬組織超微病理結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元內(nèi)Aβ沉積的影響,并考察其通過mTOR/TFEB途徑促進自噬-溶酶體途徑產(chǎn)生神經(jīng)保護作用的機制,驗證細胞實驗的結(jié)論。方法:將3月齡雄性APP/PS 1轉(zhuǎn)基因小鼠10只隨機均分為APP/PS1組和P-15組,另取同性別同月齡的C57小鼠5只作為正常對照組,P-15組灌胃給予P-15(40 mg/kg),正常對照組、APP/PS 1組灌胃給予等體積生理鹽水(NS),每日一次,連續(xù)6個月,采用避暗法和Morris水迷宮法檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。HE染色檢測小鼠的海馬CA1區(qū)的病理形態(tài)學(xué);電鏡法觀察海馬的超微結(jié)構(gòu);免疫組化法測定海馬區(qū)的神經(jīng)元內(nèi)Aβ沉積;Western blot法測定LC3-II/I比值和P62/SQSTM1的蛋白水平、Cathepsin D蛋白水平、總細胞和細胞核中的TFEB蛋白水平及p-mTOR/mTOR比值。結(jié)果:與正常對照組小鼠比較,APP/PS1小鼠在避暗實驗中的逃避潛伏期延長(p0.05),錯誤次數(shù)增加,無顯著性差異(p0.05);Morris水迷宮的逃避潛伏期明顯延長(p0.05),目的象限游泳時間的百分比明顯下降(p0.05),穿越平臺次數(shù)減少,無顯著性差異(p0.05);海馬CA1區(qū)的椎體細胞排列稀疏,胞核深染固縮;細胞質(zhì)內(nèi)細胞器溶解,突觸后膜顯著擴張,髓神經(jīng)纖維軸索呈脫髓鞘特征,神經(jīng)元內(nèi)Aβ沉積面積增加;海馬組織中的LC3-II/I和P62/SQSTM1的蛋白表達水平均增加(p0.01或p0.05),Cathepsin D的表達降低(p0.05);腦組織中總TFEB水平?jīng)]有顯著影響(p0.05),但細胞核的TFEB蛋白表達水平顯著降低(p0.05),腦組織p-mTOR/mTOR比值顯著增加(p0.05)。與APP/PS1組小鼠比較,P-15組的避暗潛伏期明顯延長(p0.01),錯誤次數(shù)降低,無顯著性差異(p0.05);Morris水迷宮的逃避潛伏期明顯縮短(p0.01),目的象限游泳時間百分比明顯增加(p0.05),穿越平臺次數(shù)增加,無顯著性差異(p0.05);海馬CA1區(qū)的病變程度和海馬組織超微結(jié)構(gòu)損傷減輕,神經(jīng)元內(nèi)Aβ沉積減少;腦組織中的LC3-II/I比值顯著性降低(p0.01),P62/SQSTM1的蛋白表達水平均降低,無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05),Cathepsin D的表達水平增加(p0.05);腦組織總蛋白中TFEB表達水平無明顯改變(p0.05),但細胞核的TFEB蛋白水平顯著增加(p0.05),腦組織p-mTOR/mTOR比值顯著降低(p0.05)。結(jié)論:P-15能改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能,改善海馬CA1的病理形態(tài)學(xué)和海馬組織的超微結(jié)構(gòu)損傷,減少神經(jīng)元內(nèi)Aβ沉積,并能通過抑制mTOR的磷酸化,提高TFEB的核轉(zhuǎn)錄水平,恢復(fù)溶酶體功能,促進自噬-溶酶體途徑發(fā)揮抗AD的作用,與細胞實驗結(jié)論一致。
【圖文】：

成都中醫(yī)藥大學(xué) 2018 屆碩士畢業(yè)生論文酸化 TFEB 將其隔離于細胞核外。饑餓或應(yīng)激條件下，mTORC1 去磷酸化，TFEB磷酸化水平下降，14-3-3 蛋白和 TFEB 結(jié)合減少，TFEB 轉(zhuǎn)錄入核。自噬誘導(dǎo)劑Rapamincy 抑制 mTORC1 磷酸化后，去磷酸化的 TFEB 入核調(diào)控溶酶體活性的作用增強[60-61]。TFEB 沉默后，，饑餓可誘導(dǎo) mTORC1 去磷酸化，但其上調(diào)溶酶體活性的作用消失[62 ]，提示 TFEB 的轉(zhuǎn)錄核與 mTORC1 磷酸化抑制呈依賴性關(guān)系。因此，mTOR/TFEB 通路對調(diào)控溶酶體功能具有重要作用。mTOR/TFEB 調(diào)控自噬-溶酶體途徑見圖 1。

本實驗技術(shù)路線圖
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2653030