【摘要】：目的:研究淫羊藿苷(Icariin,ICA)對魚藤酮(Rotenone,ROT)誘導的多巴胺能神經(jīng)元細胞損傷的保護作用,探討可能的分子機制。方法:研究分為兩個部分,即動物實驗和PC12細胞模型實驗兩個部分。1、動物實驗:75只SD雄性大鼠,220-250 g,分為空白組、ICA(30 mg/kg)組、ROT(1 mg/kg)組、ROT+ICA(15 mg/kg)組、ROT+ICA(30 mg/kg)組,連續(xù)5周頸背部皮下注射ROT(1 mg/kg/day),灌胃ICA(15 mg/kg/day或30 mg/kg/day),空白組灌胃相同體積的ddH_2O和皮下注射溶媒。轉棒實驗評估大鼠行為學功能;組織TH染色檢測大鼠中腦黑質多巴胺神經(jīng)元數(shù)量;Western blot檢測大鼠紋狀體組織中SIRT3和PGC-1α蛋白表達。2、PC12細胞實驗:PC12細胞分為空白組、ICA(4μM)組、ROT(0.5μM)組、ROT+ICA(2μM)組、ROT+ICA(4μM)組。(1)ICA對ROT的保護作用。細胞預先給予ICA干預2 h后加入ROT繼續(xù)處理24 h。MTT法檢測細胞活力;Oxygraph-2k線粒體呼吸功能儀檢測細胞線粒體呼吸功能;流式細胞儀檢測細胞ROS含量;SOD試劑盒檢測細胞內SOD活性;Western blot檢測細胞SIRT3和PGC-1α蛋白表達。(2)PGC-1αsiRNA沉默對ICA保護作用的影響。PGC-1αsiRNA轉染PC12細胞24 h后,提前2 h給與ICA,加入ROT繼續(xù)處理24 h。MTT法檢測細胞活力;Western blot檢測細胞PGC-1α和SIRT3蛋白表達水平。(3)SIRT3抑制劑3-TYP干預對ICA保護作用的影響。細胞提前2 h孵育3-TYP和ICA,加入ROT繼續(xù)處理24 h。MTT法檢測細胞活力;Oxygraph-2k線粒體呼吸功能儀檢測細胞線粒體呼吸功能;流式細胞儀檢測細胞ROS含量;SOD試劑盒檢測細胞內SOD活性;Western blot檢測細胞SIRT3和PGC-1α蛋白表達。結果:1、動物實驗:(1)通過轉棒實驗檢測動物行為學,結果顯示ROT組大鼠轉棒時間較空白組明顯減少;而給予ICA干預后,大鼠轉棒時間增加。(2)組織TH染色結果顯示:ROT組多巴胺神經(jīng)元數(shù)量明顯減少;而ICA干預明顯緩解ROT所誘導的多巴胺神經(jīng)元數(shù)量減少。(3)Western blot檢測紋狀體組織中SIRT3和PGC-1α蛋白表達水平,結果顯示:與空白組比,ROT組大鼠紋狀體組織中SIRT3和PGC-1α蛋白表達降低;給予ICA干預后,SIRT3和PGC-1α蛋白表達升高。2、PC12細胞模型實驗:(1)ICA對ROT的保護作用。ROT處理細胞24 h后,細胞活力、線粒體呼吸功能、SOD活性以及SIRT3和PGC-1α蛋白表達較空白組均降低,而ICA干預后,細胞活力、線粒體呼吸功能、SOD活性以及SIRT3和PGC-1α蛋白表達均上升。流式細胞儀檢測細胞內ROS含量,結果顯示:ROT組細胞內ROS含量較空白組升高;而ICA干預后,細胞內ROS含量降低。(2)PGC-1αsiRNA沉默對ICA保護作用的影響。PGC-1αsiRNA轉染細胞后,MTT檢測結果顯示,ICA對ROT誘導的細胞毒性表現(xiàn)出保護作用,而這一作用在siRNA轉染細胞后消失。同時Western blot檢測PGC-1α和SIRT3蛋白表達,發(fā)現(xiàn)PGC-1α的沉默并不影響SIRT3蛋白表達。(3)SIRT3抑制劑3-TYP干預對ICA保護作用的影響。MTT結果顯示,ICA對ROT誘導的細胞毒性表現(xiàn)出保護作用,而這一作用在共同孵育3-TYP后明顯消失。Western blot結果顯示:3-TYP干預會導致SIRT3蛋白表達降低,同時引起PGC-1α蛋白表達下降。進一步實驗發(fā)現(xiàn),3-TYP會抑制細胞線粒體呼吸功能、增加細胞內ROS含量、導致細胞內SOD活性的降低;同時3-TYP削弱ICA對細胞線粒體呼吸功能、ROS水平以及SOD活性的影響。結論:ICA對ROT誘導的多巴胺能神經(jīng)元細胞損傷具有保護作用,其保護機制可能與上調SIRT3、改善線粒體功能和氧化應激有關。
【圖文】：

圖 1 ICA 對 ROT 誘導的大鼠運動功能的影響ig.1 Effect of ICAon motor function of rats induced by Rn = 8, *p < 0.05 vs control group;#p < 0.05 vs ROT group.護 ROT 誘導的多巴胺能神經(jīng)元損傷元的的丟失是 PD 模型重要病理特征之一。大鼠經(jīng)H 染色檢測中腦黑質組織中 DA 神經(jīng)元數(shù)量，結果經(jīng)元數(shù)量較正常組、正常給藥組減少大約 52%（ DA 神經(jīng)元數(shù)量顯著升高（圖 2）。

圖 2 ICA 對 ROT 誘導的中腦黑質多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的影響Fig.2 Effect of ICA on ROT-induced DA neuronal loss in the rat substantia nigra.n = 5, **p < 0.01 vs control group;#p < 0.05 vs ROT group.2.3 ICA 對紋狀體中 SIRT3 和 PGC-1α蛋白表達的影響大鼠給藥 5 周后，取紋狀體組織，Western blot 法檢測大鼠紋狀體組織中SIRT3 和 PGC-1α蛋白表達。結果顯示:與空白組比較，ROT 處理導致紋狀體中SIRT3 和 PGC-1α蛋白表達降低（p < 0.05）；而與 ROT 單獨處理組相比，給予ICA 干預后，紋狀體中 SIRT3 和 PGC-1α蛋白表達明顯增高（圖 3）。
【學位授予單位】：遵義醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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