發(fā)布時間：2020-05-07 12:45

【摘要】：目的:研究淫羊藿苷(Icariin,ICA)對魚藤酮(Rotenone,ROT)誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,探討可能的分子機(jī)制。方法:研究分為兩個部分,即動物實驗和PC12細(xì)胞模型實驗兩個部分。1、動物實驗:75只SD雄性大鼠,220-250 g,分為空白組、ICA(30 mg/kg)組、ROT(1 mg/kg)組、ROT+ICA(15 mg/kg)組、ROT+ICA(30 mg/kg)組,連續(xù)5周頸背部皮下注射ROT(1 mg/kg/day),灌胃ICA(15 mg/kg/day或30 mg/kg/day),空白組灌胃相同體積的ddH_2O和皮下注射溶媒。轉(zhuǎn)棒實驗評估大鼠行為學(xué)功能;組織TH染色檢測大鼠中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)量;Western blot檢測大鼠紋狀體組織中SIRT3和PGC-1α蛋白表達(dá)。2、PC12細(xì)胞實驗:PC12細(xì)胞分為空白組、ICA(4μM)組、ROT(0.5μM)組、ROT+ICA(2μM)組、ROT+ICA(4μM)組。(1)ICA對ROT的保護(hù)作用。細(xì)胞預(yù)先給予ICA干預(yù)2 h后加入ROT繼續(xù)處理24 h。MTT法檢測細(xì)胞活力;Oxygraph-2k線粒體呼吸功能儀檢測細(xì)胞線粒體呼吸功能;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞ROS含量;SOD試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)SOD活性;Western blot檢測細(xì)胞SIRT3和PGC-1α蛋白表達(dá)。(2)PGC-1αsiRNA沉默對ICA保護(hù)作用的影響。PGC-1αsiRNA轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞24 h后,提前2 h給與ICA,加入ROT繼續(xù)處理24 h。MTT法檢測細(xì)胞活力;Western blot檢測細(xì)胞PGC-1α和SIRT3蛋白表達(dá)水平。(3)SIRT3抑制劑3-TYP干預(yù)對ICA保護(hù)作用的影響。細(xì)胞提前2 h孵育3-TYP和ICA,加入ROT繼續(xù)處理24 h。MTT法檢測細(xì)胞活力;Oxygraph-2k線粒體呼吸功能儀檢測細(xì)胞線粒體呼吸功能;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞ROS含量;SOD試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)SOD活性;Western blot檢測細(xì)胞SIRT3和PGC-1α蛋白表達(dá)。結(jié)果:1、動物實驗:(1)通過轉(zhuǎn)棒實驗檢測動物行為學(xué),結(jié)果顯示ROT組大鼠轉(zhuǎn)棒時間較空白組明顯減少;而給予ICA干預(yù)后,大鼠轉(zhuǎn)棒時間增加。(2)組織TH染色結(jié)果顯示:ROT組多巴胺神經(jīng)元數(shù)量明顯減少;而ICA干預(yù)明顯緩解ROT所誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元數(shù)量減少。(3)Western blot檢測紋狀體組織中SIRT3和PGC-1α蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與空白組比,ROT組大鼠紋狀體組織中SIRT3和PGC-1α蛋白表達(dá)降低;給予ICA干預(yù)后,SIRT3和PGC-1α蛋白表達(dá)升高。2、PC12細(xì)胞模型實驗:(1)ICA對ROT的保護(hù)作用。ROT處理細(xì)胞24 h后,細(xì)胞活力、線粒體呼吸功能、SOD活性以及SIRT3和PGC-1α蛋白表達(dá)較空白組均降低,而ICA干預(yù)后,細(xì)胞活力、線粒體呼吸功能、SOD活性以及SIRT3和PGC-1α蛋白表達(dá)均上升。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量,結(jié)果顯示:ROT組細(xì)胞內(nèi)ROS含量較空白組升高;而ICA干預(yù)后,細(xì)胞內(nèi)ROS含量降低。(2)PGC-1αsiRNA沉默對ICA保護(hù)作用的影響。PGC-1αsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,MTT檢測結(jié)果顯示,ICA對ROT誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性表現(xiàn)出保護(hù)作用,而這一作用在siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后消失。同時Western blot檢測PGC-1α和SIRT3蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)PGC-1α的沉默并不影響SIRT3蛋白表達(dá)。(3)SIRT3抑制劑3-TYP干預(yù)對ICA保護(hù)作用的影響。MTT結(jié)果顯示,ICA對ROT誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性表現(xiàn)出保護(hù)作用,而這一作用在共同孵育3-TYP后明顯消失。Western blot結(jié)果顯示:3-TYP干預(yù)會導(dǎo)致SIRT3蛋白表達(dá)降低,同時引起PGC-1α蛋白表達(dá)下降。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn),3-TYP會抑制細(xì)胞線粒體呼吸功能、增加細(xì)胞內(nèi)ROS含量、導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SOD活性的降低;同時3-TYP削弱ICA對細(xì)胞線粒體呼吸功能、ROS水平以及SOD活性的影響。結(jié)論:ICA對ROT誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,其保護(hù)機(jī)制可能與上調(diào)SIRT3、改善線粒體功能和氧化應(yīng)激有關(guān)。
【圖文】：

圖 1 ICA 對 ROT 誘導(dǎo)的大鼠運動功能的影響ig.1 Effect of ICAon motor function of rats induced by Rn = 8, *p < 0.05 vs control group;#p < 0.05 vs ROT group.護(hù) ROT 誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷元的的丟失是 PD 模型重要病理特征之一。大鼠經(jīng)H 染色檢測中腦黑質(zhì)組織中 DA 神經(jīng)元數(shù)量，結(jié)果經(jīng)元數(shù)量較正常組、正常給藥組減少大約 52%（ DA 神經(jīng)元數(shù)量顯著升高（圖 2）。

圖 2 ICA 對 ROT 誘導(dǎo)的中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的影響Fig.2 Effect of ICA on ROT-induced DA neuronal loss in the rat substantia nigra.n = 5, **p < 0.01 vs control group;#p < 0.05 vs ROT group.2.3 ICA 對紋狀體中 SIRT3 和 PGC-1α蛋白表達(dá)的影響大鼠給藥 5 周后，取紋狀體組織，Western blot 法檢測大鼠紋狀體組織中SIRT3 和 PGC-1α蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示:與空白組比較，ROT 處理導(dǎo)致紋狀體中SIRT3 和 PGC-1α蛋白表達(dá)降低（p < 0.05）；而與 ROT 單獨處理組相比，給予ICA 干預(yù)后，紋狀體中 SIRT3 和 PGC-1α蛋白表達(dá)明顯增高（圖 3）。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2652992