【摘要】：當(dāng)歸是治療貧血的傳統(tǒng)中藥,當(dāng)歸多糖(Angelica sinensis polysaccharide,ASP)是從當(dāng)歸飲片中分離純化得到的水溶性大分子多糖。鐵調(diào)素(hepcidin)是機(jī)體鐵代謝平衡的核心調(diào)控者,hepcidin高表達(dá)在炎癥性貧血和腎性貧血的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)是調(diào)控紅細(xì)胞生成的必需生長因子,EPO缺乏是引起腎性貧血的主要原因。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)ASP可以調(diào)節(jié)缺鐵性貧血大鼠鐵代謝,降低大鼠血清hepcidin水平,改善貧血。近年來在中藥治療腎性貧血的研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸及當(dāng)歸補血湯輔助重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)治療腎性貧血具有療效好、安全性高的特點,且能顯著減少rhEPO的用量。本文旨在研究ASP抑制hepcidin表達(dá)的作用機(jī)制,探討ASP對EPO表達(dá)的作用,研究ASP對炎癥性貧血和腎性貧血的療效和作用機(jī)制,為開發(fā)新型炎癥性貧血和腎性貧血的治療藥物提供新思路,也對闡明中藥當(dāng)歸治療貧血的作用機(jī)理有積極的作用。本文主要研究內(nèi)容和成果如下:第一部分當(dāng)歸多糖體外抑制hepcidin表達(dá)的研究根據(jù)本課題組前期建立的當(dāng)歸多糖分離純化工藝制備ASP,對其糖含量、純度、分子量、紅外圖譜等進(jìn)行質(zhì)量考察。結(jié)果表明提取的ASP性狀均一,產(chǎn)率較高,性質(zhì)穩(wěn)定,達(dá)到了后續(xù)實驗的要求。采用重組人IL-6細(xì)胞因子刺激HepG2細(xì)胞hepcidin表達(dá),分別加入50、100、200?g/mL ASP共培養(yǎng),通過蛋白質(zhì)免疫印跡法和免疫熒光分別檢測STAT3的磷酸化水平和核轉(zhuǎn)錄,采用實時熒光定量PCR檢測hepcidin mRNA表達(dá)。結(jié)果表明,ASP顯著抑制了IL-6誘導(dǎo)的STAT3磷酸化和核轉(zhuǎn)錄,下調(diào)了hepcidin mRNA水平,三個濃度ASP對hepcidin mRNA的抑制率分別為58.8%、66.5%、74.7%,呈劑量依賴性。為進(jìn)一步探究ASP下調(diào)IL-6誘導(dǎo)的STAT3激活和hepcidin表達(dá)的作用靶點,加入JAK2蛋白抑制劑AZD1480,研究了ASP在加入AZD1480情況下對IL-6誘導(dǎo)的hepcidin表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在加入AZD1480干預(yù)后,ASP對IL-6誘導(dǎo)的p-JAK2及hepcidin mRNA表達(dá)無顯著影響,表明ASP可能通過抑制JAK2蛋白激活下調(diào)JAK2/STAT3信號通路,進(jìn)而抑制hepcidin轉(zhuǎn)錄。采用重組人BMP6細(xì)胞因子刺激HepG2細(xì)胞hepcidin表達(dá),加入BMP I型受體抑制劑LDN-193189干預(yù),觀察了200?g/mL ASP在未加入以及加入LDN-193189情況下對p-SMAD1/5/8和hepcidin mRNA表達(dá)的影響。研究表明,ASP能顯著抑制BMP6誘導(dǎo)的p-SMAD1/5/8和hepcidin mRNA表達(dá),而在加入LDN-193189干預(yù)的細(xì)胞中,ASP組p-SMAD1/5/8和hepcidin mRNA的表達(dá)相較于BMP6組無顯著變化,提示ASP可能通過作用于BMP I型受體來下調(diào)BMP/SMAD通路,進(jìn)而抑制hepcidin轉(zhuǎn)錄。給予HepG2細(xì)胞脂多糖(lypopolysaccharide,LPS)刺激,分別加入50、100、200μg/mL ASP共培養(yǎng),考察ASP對LPS刺激的p-STAT3、p-SMAD1/5/8、hepcidin mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明,與LPS組相比,三個濃度ASP均顯著下調(diào)了LPS誘導(dǎo)的p-STAT3和p-SMAD1/5/8;100、200μg/mL ASP組hepcidin mRNA水平相較于LPS組均顯著降低,抑制率分別為48%和86.6%,而低濃度ASP組無顯著性差異。酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測細(xì)胞上清液IL-6水平可知,三個濃度ASP明顯抑制了LPS刺激的IL-6分泌,抑制率分別為58.8%、66.5%、74.7%,具有劑量依賴性。蛋白質(zhì)印跡法檢測NF-?B、p-I?B?表達(dá)表明,ASP阻斷了LPS誘導(dǎo)的I?B?的磷酸化及核NF-?B的表達(dá)。根據(jù)本部分實驗結(jié)果可知ASP抑制hepcidin表達(dá)的機(jī)制為:(1)可能通過抑制JAK2蛋白激活下調(diào)JAK2/STAT3信號通路,進(jìn)而抑制hepcidin轉(zhuǎn)錄;(2)可能通過阻斷BMP6與BMP I型受體相互作用下調(diào)BMP/SMAD信號通路,進(jìn)而抑制hepcidin轉(zhuǎn)錄;(3)通過抑制NF-?B信號通路減少IL-6分泌間接抑制hepcidin表達(dá)。本研究為后續(xù)ASP作為hepcidin抑制劑治療鐵限制性貧血的體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分當(dāng)歸多糖改善炎癥性貧血的體內(nèi)研究采用給大鼠足跖皮下注射0.15 mL結(jié)核分枝桿菌濃度為10 mg/mL的弗氏完全佐劑建立炎癥性貧血模型,設(shè)立雙氯芬酸鈉、rhEPO、雙氯芬酸鈉和rhEPO聯(lián)合給藥三個陽性對照組,分別以0.5 g/kg、1.0 g/kg體重劑量給大鼠灌胃ASP溶液治療4周。實驗結(jié)束后檢測大鼠血紅蛋白(Hb)水平和紅細(xì)胞(RBC)計數(shù)。由結(jié)果可知,低、高劑量ASP均顯著升高了ACD大鼠Hb水平和RBC計數(shù),低劑量ASP組Hb水平和RBC計數(shù)分別升高至135.56 g/L、7.74×10~(12)/L,高劑量ASP組為145.29 g/L、8.5×10~(12)/L。與陽性對照組相比,高劑量ASP對貧血的改善作用與雙氯芬酸鈉、rhEPO相當(dāng),但弱于雙氯芬酸鈉和rhEPO聯(lián)合給藥。檢測大鼠白細(xì)胞計數(shù)(WBC)和血清TNF-?、IL-6水平可知ASP的治療明顯降低了ACD大鼠WBC計數(shù)和血清TNF-?、IL-6水平。此外ASP顯著升高了ACD大鼠血清EPO水平。采用普魯士藍(lán)染色觀察大鼠脾臟組織鐵沉積,原子吸收光譜法檢測脾臟鐵和血清鐵水平,ELISA檢測血清ferritin水平。由結(jié)果可知,模型組大鼠脾臟組織顯示出明顯的鐵沉積,脾臟鐵含量相較于對照組顯著升高了61.4%,血清鐵下降了27.2%,表明ACD大鼠組織鐵過載,循環(huán)鐵利用率低;給藥ASP治療后,大鼠脾臟鐵沉積得到明顯改善,血清ferritin水平降低,血清鐵水平升高。檢測大鼠血清hepcidin水平和肝臟hepcidin表達(dá)可知,給藥低、高劑量ASP治療后血清hepcidin水平分別下降了14.6%和21.3%,肝臟hepcidin表達(dá)也顯著下調(diào)。為探究ASP改善ACD大鼠鐵代謝、炎性的具體分子機(jī)制,采用蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠相關(guān)蛋白表達(dá),包括(1)肝臟調(diào)控hepcidin轉(zhuǎn)錄的上游JAK2/STAT3信號通路蛋白p-JAK2、p-STAT3、STAT3,BMP/SMAD信號通路蛋白BMP6、p-SMAD1/5/8、SMAD4;(2)脾臟、肝臟鐵代謝相關(guān)蛋白ferroportin和ferritin;(3)肝臟NF-?B信號通路蛋白IKK?、p-I?B?和NF-?B。結(jié)果顯示,ASP顯著下調(diào)了ACD大鼠肝臟JAK2/STAT3和BMP/SMAD通路,升高了脾臟、肝臟ferroportin表達(dá),降低了ferritin水平,抑制了NF-?B信號通路的激活。本部分研究表明ASP主要通過抑制hepcidin表達(dá)和抗炎兩方面改善炎癥性貧血,具體機(jī)制分別為:(1)通過下調(diào)JAK2/STAT3和BMP/SMAD通路抑制hepcidin表達(dá),進(jìn)而升高脾臟、肝臟ferroportin表達(dá),增加組織鐵輸出,從而改善大鼠單核巨噬系統(tǒng)鐵沉積,提高循環(huán)鐵利用率;(2)通過抑制NF-κB的激活下調(diào)炎性因子的分泌,一方面間接抑制hepcidin表達(dá),另一方面緩解炎性因子對EPO的抑制作用。本部分研究為ASP作為hepcidin抑制劑防治炎癥性貧血提供新的理論和實驗依據(jù)。第三部分當(dāng)歸多糖體外上調(diào)EPO表達(dá)的研究本實驗采用在培養(yǎng)基中加入50?M CoCl_2刺激Hep3B細(xì)胞24小時誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧,加入100、200?g/mL兩種濃度ASP共培養(yǎng),觀察ASP對缺氧誘導(dǎo)HIF-1/2?蛋白和EPO mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,與缺氧組相比,兩種濃度ASP均顯著上調(diào)HIF-1(14)2?蛋白以及EPO mRNA的表達(dá),且呈劑量依賴性。檢測HIF-1/2?mRNA表達(dá)量可知ASP對HIF-1/2?mRNA水平無顯著影響。為探究ASP上調(diào)HIF-1(14)2?蛋白表達(dá)的作用機(jī)制,加入放線菌酮處理Hep3B細(xì)胞不同的時間,以抑制蛋白合成檢測蛋白的半衰期。結(jié)果表明,缺氧誘導(dǎo)的HIF-1(14)2?蛋白半衰期約為0.5 h,而200?g/mL ASP的加入顯著延長了蛋白的半衰期大約至3 h。分別采用重組人TNF-?和IL-1?刺激Hep3B細(xì)胞,加入100、200?g/mL兩種濃度ASP共培養(yǎng),觀察ASP對炎性因子抑制EPO表達(dá)的影響。由結(jié)果可知,100、200?g/mL ASP的干預(yù)顯著抑制了TNF-?和IL-1?誘導(dǎo)的GATA2、NF-?B激活,緩解了TNF-?和IL-1?對EPO的抑制作用,上調(diào)了EPO mRNA表達(dá),且呈劑量依賴性。接下來觀察了ASP對TNF-?在缺氧條件下抑制EPO表達(dá)的影響,與對照組相比,缺氧明顯上調(diào)了核NF-?B和GATA2的表達(dá),TNF-?的加入進(jìn)一步增加了核NF-?B和GATA2的水平,而200?g/mL ASP組NF-?B和GATA2的表達(dá)水平明顯減少,且顯著性低于缺氧對照組水平。檢測EPO mRNA結(jié)果顯示,ASP顯著緩解了TNF-?在缺氧條件下對EPO的抑制作用,且與缺氧對照組相比,ASP組EPO mRNA水平更高。本部分的研究結(jié)果表明:(1)ASP通過抑制HIF-2?蛋白降解,延長HIF-2?蛋白的半衰期,進(jìn)而刺激缺氧誘導(dǎo)EPO的表達(dá),也可能通過抑制缺氧誘導(dǎo)的GATA2、NF-?B激活進(jìn)一步上調(diào)EPO表達(dá);(2)ASP可以顯著緩解炎性因子TNF-?、IL-1?對EPO的抑制作用,該作用與下調(diào)核核轉(zhuǎn)錄因子GATA2、NF-?B有關(guān);(3)ASP能顯著緩解TNF-?在缺氧條件下對EPO的抑制作用,一方面通過阻斷GATA2、NF-?B激活,一方面可能通過上調(diào)HIF-2?蛋白表達(dá)促進(jìn)EPO的轉(zhuǎn)錄。該部分研究為后續(xù)ASP改善腎性貧血的體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。第四部分當(dāng)歸多糖改善腎性貧血的體內(nèi)研究采用給大鼠先喂食含0.75%腺嘌呤飼料4周再喂食正常飼料4周的方法建立慢性腎臟病(CKD)貧血大鼠模型,以rhEPO為陽性對照藥物,給予0.5 g/kg、1.0 g/kg ASP治療6周。實驗期間監(jiān)測大鼠血常規(guī)指標(biāo)包括Hb、RBC和WBC,及腎功能指標(biāo)血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)。結(jié)果表明,CKD大鼠在第4周開始出現(xiàn)貧血,至第6周最為嚴(yán)重,后略有回升,到8周時趨于穩(wěn)定貧血狀態(tài)。ASP在給藥治療4周后即第6周時顯著上調(diào)了Hb水平和RBC計數(shù),隨后Hb水平和RBC計數(shù)逐漸回升,到第8周時接近正常值,基本糾正了貧血,高劑量ASP作用最顯著。由BUN和Scr水平再結(jié)合大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果可知,ASP的治療在一定程度上改善了CKD大鼠腎功能,緩解了腎組織病變。此外,ASP顯著降低了CKD大鼠WBC水平,抑制了CKD大鼠腎臟和脾臟促炎性因子TNF-?、IL-1?和IL-6 mRNA表達(dá),緩解了大鼠炎癥反應(yīng)。鐵代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測結(jié)果表明,ASP降低了CKD大鼠脾臟鐵和肝臟鐵含量;與模型組相比,EPO組、LASP組和HASP組血清鐵水平分別升高了21.7%、44.8%和53.1%。實驗結(jié)束后檢測CKD大鼠EPO水平得知,低劑量ASP和高劑量ASP組血清EPO水平相較于模型組分別升高了1.3倍和1.7倍;ASP的治療顯著上調(diào)了CKD大鼠腎臟及肝臟EPO mRNA表達(dá),其中低劑量ASP組分別升高了6.5倍、89.2%,高劑量組分別升高了9.1倍、1.3倍。檢測大鼠肝臟hepcidin mRNA表達(dá)可知,ASP顯著抑制了CKD大鼠肝臟hepcidin表達(dá),LASP組和HASP組的抑制率分別為54.1%、76.8%。為探究ASP刺激CKD大鼠內(nèi)源性EPO分泌的機(jī)制,檢測大鼠腎臟、肝臟HIF-1?、HIF-2?、GATA2和NF-?B蛋白表達(dá)以及脯氨酸羥化酶PHD1、PHD2和PHD3 mRNA表達(dá)。由結(jié)果可知,ASP激活了CKD大鼠腎臟、肝臟HIF信號通路,抑制了PHD1/2/3mRNA表達(dá),增加了HIF-1/2蛋白積聚;ASP抑制了CKD大鼠腎臟、肝臟GATA2和NF-?B表達(dá)。由結(jié)果分析可知ASP刺激CKD大鼠內(nèi)源性腎臟和肝臟EPO分泌的機(jī)制如下:(1)通過抑制HIF-2?蛋白降解,增加HIF-2?蛋白水平上調(diào)EPO基因轉(zhuǎn)錄;(2)通過抑制NF-?B和GATA2激活,緩解NF-?B和GATA2對EPO基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用增加EPO表達(dá);(3)可能通過改善炎性,緩解炎性對缺氧誘導(dǎo)HIF信號通路抑制作用間接增加EPO表達(dá)。提取CKD大鼠骨髓單個核細(xì)胞,研究EPO介導(dǎo)的下游細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)果表明ASP顯著增加了骨髓單個核細(xì)胞EPOR mRNA的表達(dá);激活了EPOR下游JAK2/STAT5、PI3K/Akt通路,上調(diào)了p-JAK2、p-STAT5、p-PI3K和p-Akt表達(dá);增加了信號通路下游抗凋亡基因Bcl-xL mRNA水平和Bcl-2/Bax比例以及鐵代謝相關(guān)基因TfR1、ERFE mRNA的表達(dá)。以上結(jié)果表明ASP的治療上調(diào)了CKD大鼠骨髓單個核細(xì)胞EPOR表達(dá),從而增強(qiáng)了骨髓紅系細(xì)胞對EPO的響應(yīng);激活了EPOR下游細(xì)胞內(nèi)JAK2/STAT5、PI3K/Akt信號通路,上調(diào)了抗凋亡和鐵代謝相關(guān)目的基因的表達(dá),從而抑制了紅系細(xì)胞凋亡,促進(jìn)其增殖分化,增加了紅系細(xì)胞對鐵的利用,促進(jìn)血紅蛋白的合成。研究ASP改善CKD大鼠鐵代謝的機(jī)制結(jié)果可知,ASP下調(diào)了p-STAT3、p-SMAD1/5/8表達(dá);增加了肝臟、脾臟ferroportin蛋白水平;減少了肝臟、脾臟ferritin蛋白水平;抑制了脾臟DMT1和TfR1 mRNA表達(dá)。由結(jié)果分析可知ASP改善CKD大鼠組織鐵沉積,升高循環(huán)鐵水平的分子機(jī)制總結(jié)如下:(1)ASP通過下調(diào)STAT3和SMAD信號通路抑制了CKD大鼠肝臟hepcidin表達(dá),進(jìn)而上調(diào)了大鼠脾臟和肝臟ferroportin的水平,最終增加了大鼠脾臟鐵和肝臟鐵的輸出;(2)ASP可能通過改善炎性抑制了CKD大鼠ferritin表達(dá),從而減少了大鼠肝臟、脾臟鐵的儲存;(3)ASP可能通過改善炎性減少了CKD大鼠DMT1和TfR1 mRNA水平,從而減少了巨噬細(xì)胞對鐵的攝入。本部分研究表明ASP通過刺激內(nèi)源性腎臟、肝臟EPO產(chǎn)生升高了血清EPO水平,增加了骨髓單個核細(xì)胞EPOR mRNA表達(dá),進(jìn)而激活了EPOR下游細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)了紅細(xì)胞生成;通過抑制hepcidin表達(dá)和改善炎性動員了組織鐵的利用,升高了血清鐵水平,增加了紅細(xì)胞生成所需要的鐵原料的供應(yīng),最終糾正了腎性貧血。本文為開發(fā)新型腎性貧血的治療藥物提供新思路,也揭示了中藥當(dāng)歸輔助治療腎性貧血的機(jī)理。
【圖文】：

圖 1-1 Hepcidin 對機(jī)體鐵平衡的調(diào)控[39]ig.1-1 Hepcidin has a central role in maintenance of iron homeosta為傳統(tǒng)治療貧血的中草藥，其在調(diào)節(jié)鐵代謝，抑制 hepcidin 方。本課題組從當(dāng)歸飲片中提取分離純化得到大分子化合物 AS ASP 能改善缺鐵性貧血大鼠鐵代謝，降低缺鐵性貧血大鼠血深入探討 ASP 對 hepcidin 表達(dá)的抑制作用及機(jī)制，將對 ASP病及闡明中藥當(dāng)歸治療貧血的作用機(jī)理有積極的作用。主要研究ASP對炎癥因子依賴JAK2/STAT3通路介導(dǎo)的hepci鐵水平依賴 BMP/SMAD 通路介導(dǎo)的 hepcidin 表達(dá)的作用。根工藝，采用熱水提、乙醇沉淀的方法分離當(dāng)歸粗多糖，再經(jīng)反及葡聚糖凝膠色譜柱分級純化得到 ASP。采用人肝癌 HepG26細(xì)胞因子刺激HepG2細(xì)胞hepcidin表達(dá)，，研究ASP對IL-6誘導(dǎo)

23圖 1-2 當(dāng)歸多糖提�。ˋ）、純化（B）流程圖Fig.1-2 Scheme of the extraction and purification ofASP糖糖含量測定酚-硫酸法對當(dāng)歸多糖的糖含量進(jìn)行測定[45]。譜掃描0 mg 當(dāng)歸多糖樣品，溶解于 0.1 M NaOH 溶液配制成 1 mg/mL 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 林攀;丁小強(qiáng);袁敏;劉紅;;慢性腎臟病患者貧血患病現(xiàn)況調(diào)查[J];復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2009年05期

2 王強(qiáng),廖清奎;一氧化氮對慢性病貧血大鼠鐵代謝影響[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2003年04期

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本文編號：2652926