【摘要】：選題依據(jù):抑郁癥是以持續(xù)情緒低落和認(rèn)知功能障礙為主要臨床特征,具有高患病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率發(fā)病和高致死率等特點(diǎn),其危害已越來越引起醫(yī)藥衛(wèi)生界的重視。由于抑郁癥的病因復(fù)雜且發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前關(guān)于抑郁癥的治療仍未取得根本突破。因此,闡明抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)療效確切的抗抑郁藥物是醫(yī)藥工作者的首要任務(wù)。當(dāng)歸作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“補(bǔ)血活血”要藥,素有“十方九歸”之美稱,“藥王”之美譽(yù)。相關(guān)研究表明當(dāng)歸在經(jīng)典抗抑郁復(fù)方中使用頻率高且占有重要地位,如逍遙散、無憂湯、當(dāng)歸芍藥散、抑肝散等,且進(jìn)一步研究表明單味藥當(dāng)歸在慢性束縛應(yīng)激模型、CUMS模型、和小鼠絕望模型也具有確切的抗抑郁作用。然而,這些報(bào)道僅觀察了當(dāng)歸對抑郁癥模型的抑郁癥狀的改善作用,并未關(guān)注當(dāng)歸對抑郁癥模型血液系統(tǒng)的影響。此外,抑郁癥模型是否存在血液系統(tǒng)紊亂的現(xiàn)象,當(dāng)歸抗抑郁作用機(jī)制又是什么,這些問題尚不明確。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)歸中部分化合物的抗抑郁活性,如:阿魏酸、香草酸、丁苯酞。然而,關(guān)于當(dāng)歸化學(xué)成分的抗抑郁活性仍無系統(tǒng)的研究報(bào)道。本研究將1)從當(dāng)歸單味藥層面出發(fā),明確當(dāng)歸對抑郁癥模型的抑郁樣癥狀和血液系統(tǒng)紊亂的改善作用,并明確兩者間的的相關(guān)性和機(jī)制,不僅為當(dāng)歸藥性理論的拓展提供科學(xué)依據(jù),還將為抑郁癥的臨床治療提供新的策略;2)從當(dāng)歸單體層面出發(fā),系統(tǒng)地從當(dāng)歸中篩選具有抗抑郁作用活性成分,并對有效成分的作用機(jī)制進(jìn)行探討,為從中藥當(dāng)歸中開發(fā)臨床療效確切、質(zhì)量可控的抗抑郁天然產(chǎn)物奠定藥理學(xué)基礎(chǔ)。目的:(1)明確當(dāng)歸對抑郁癥模型的抑郁樣癥狀和血液系統(tǒng)紊亂的改善作用;并從代謝組學(xué)和分子生物學(xué)角度闡明當(dāng)歸抗抑郁作用與調(diào)節(jié)血液系統(tǒng)間的相關(guān)性及機(jī)制;(2)從當(dāng)歸中系統(tǒng)篩選具有抗抑郁作用的天然小分子化合物;(3)驗(yàn)證主要活性成分阿魏酸松柏酯體內(nèi)抗抑郁活性進(jìn)行,并闡釋其作用機(jī)制。方法:(1)采用孤養(yǎng)結(jié)合CUMS抑郁模型,以體重、糖水偏愛率、水平穿越格數(shù)、直立次數(shù)以及強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間為指標(biāo),明確當(dāng)歸對CUMS模型抑郁樣癥狀的改善作用;再以外周血象、血?dú)狻⒁约把髯優(yōu)橹笜?biāo),明確當(dāng)歸對CUMS模型大鼠血液系統(tǒng)紊亂的改善作用,并對當(dāng)歸的抗抑郁作用與調(diào)節(jié)血液系統(tǒng)功能進(jìn)行相關(guān)性分析;以血清和肝臟(貯藏血液的器官)生物樣本為研究對象,采用UPLC-MS/MS和NMR代謝組學(xué)技術(shù),分析當(dāng)歸對差異代謝物和代謝通路的調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而闡明當(dāng)歸的抗抑郁作用及其與調(diào)節(jié)血液系統(tǒng)間的相關(guān)性機(jī)制;最后采用Western blotting技術(shù)檢測當(dāng)歸對CUMS大鼠肝臟中的HIF-1α、PDK-1和LDHA的蛋白表達(dá)量的影響,明確HIF-1α介導(dǎo)的能量代謝途徑在當(dāng)歸通過養(yǎng)血發(fā)揮解郁功效中的重要作用。(2)采用超臨界CO_2技術(shù)萃取獲得當(dāng)歸提取物,運(yùn)用多種色譜分離方法對當(dāng)歸提取物進(jìn)行分離獲得單體成分,通過波譜解析(NMR、MS)對得到的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定;再結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道從市場上購買已知的當(dāng)歸的化學(xué)成分。通過以上兩種方式獲得當(dāng)歸的單體成分,為當(dāng)歸抗抑郁活性化合物的篩選奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。再分別采用皮質(zhì)酮、谷氨酸、和H_2O_2損傷的PC12細(xì)胞模型,以細(xì)胞存活率為指標(biāo),對所獲得的單體化合物進(jìn)行抗抑郁活性篩選;最后運(yùn)用神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑高通量篩選模型對所獲得的單體化合物進(jìn)行抗抑郁活性篩選。(3)采用小鼠懸尾試驗(yàn)和小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)對主要活性成分阿魏酸松柏酯的體內(nèi)抗抑郁藥效進(jìn)行驗(yàn)證;采用MTT法和LDH釋放法檢測阿魏酸松柏酯對谷氨酸損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率、線粒體膜電位(MMPs)、細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度和活性氧(ROS);采用試劑盒法測定SOD活性和丙二醛(MDA)水平;采用Western blot技術(shù)檢測p-NR2B、p-CaMK II、p-JNK、p-p38、細(xì)胞色素C、Bax、Bcl-2、caspase-3水平。結(jié)果:(1)7.5 g生藥/kg和15 g生藥/kg的當(dāng)歸能顯著逆轉(zhuǎn)CUMS引起的大鼠體重、糖水偏愛率、穿越格數(shù)和直立次數(shù)顯著性降低,強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間顯著性升高。慢性不可預(yù)知刺激大鼠28天能使SD大鼠出現(xiàn)平均紅細(xì)胞體積(MCV)、單核細(xì)胞百分比(MO%)、血氧分壓(PO_2)、血氧飽和度(sO_2)、pH顯著性降低,紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、二氧化碳分壓(PCO_2)和全血粘度顯著升高的現(xiàn)象,當(dāng)歸能在一定程度上逆轉(zhuǎn)CUMS引起的血液系統(tǒng)紊亂。進(jìn)一步研究結(jié)果表明,行為學(xué)綜合指標(biāo)與血液系統(tǒng)綜合指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)較高,當(dāng)歸的抗抑郁作用與其養(yǎng)血功效具有較高的相關(guān)性。代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示,與空白組相比,CUMS抑郁模型大鼠血清中的40個(gè)生物標(biāo)志物和肝臟中的47個(gè)生物標(biāo)志物均發(fā)生了顯著性變化,給予當(dāng)歸干預(yù)后,血清中的26個(gè)和肝臟中的27個(gè)差異代謝物被顯著性回調(diào)。此外,當(dāng)歸還能抑制CUMS抑郁大鼠的HIF-1α、PDK-1和LDHA的過表達(dá)。(2)從當(dāng)歸藥材中分離得到12個(gè)單體化合物,其中包括Z-丁烯基苯酞(1)、藁本內(nèi)酯(2)、E-丁烯基苯酞(3)、棕櫚酸(4)、cis-Z,Z'-3a.7a',7a.3a'-dihydroxyligustilide(5)、Tokinolide A(6)、Tokinolide C(7)、β-谷甾醇(8)、Riligustilide(9)、12-異戊烯酰基-14-乙�；�-2E,8E,10E-三烯-4,6-二炔-1-醇(10)、法卡林二醇(11)、阿魏酸松柏酯(12)。Tokinolide C是未經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物。從市場上購買到的當(dāng)歸中的化合物11個(gè),其中包括洋川芎內(nèi)酯A(13)、洋川芎內(nèi)酯H(14)、洋川芎內(nèi)酯I(15)、新蛇床內(nèi)酯(16)、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A(17)、阿魏酸(18)、5-羥甲基糠醛(19)、歐前胡素(20)、香草酸(21)、傘形花內(nèi)酯(22)、正丁基苯酞(23)。體外實(shí)驗(yàn)研究表明,洋川芎內(nèi)酯A和阿魏酸對皮質(zhì)酮損傷的PC12細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用;藁本內(nèi)酯、Z-丁烯基苯酞、阿魏酸松柏酯和Tokinolide A對谷氨酸損傷的PC12細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用;洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I和正丁基苯酞對H_2O_2損傷的PC12細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。此外,5-羥甲基糠醛和阿魏酸松柏酯對ASP+有明顯的抑制作用。(3)阿魏酸松柏酯能顯著性縮短TST、FST的小鼠不動時(shí)間;抑制谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率下降、LDH釋放、細(xì)胞凋亡率升高;抑制谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞Ca~(2+)內(nèi)流、p-NR2B、p-CaMK II、p-JNK、p-p38水平升高;抑制谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞ROS生成,SOD活性降低,MDA水平升高;抑制谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞MMPs下降,Bcl-2/Bax介導(dǎo)的線粒體凋亡通路的激活。結(jié)論:(1)當(dāng)歸能有效改善CUMS模型大鼠的抑郁樣癥狀和血液系統(tǒng)紊亂現(xiàn)象。當(dāng)歸的抗抑郁作用與其調(diào)節(jié)血液系統(tǒng)功能密切相關(guān),其機(jī)制可能能涉及TCA循環(huán)、糖代謝、氨基酸代謝、鞘脂代謝、甘油脂代謝、�；撬岽x、和脂類代謝。HIF-1α信號通路介導(dǎo)的能量代謝途徑是當(dāng)歸通過養(yǎng)血發(fā)揮解郁作用的重要途徑之一。(2)洋川芎內(nèi)酯A、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、Z-丁烯基苯酞、阿魏酸松柏酯、Tokinolide A、洋川芎內(nèi)酯I、正丁基苯酞和5-羥甲基糠醛可能是當(dāng)歸抗抑郁藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。(3)阿魏酸松柏酯在體內(nèi)外均表現(xiàn)出較好的抗抑郁作用,其機(jī)制與調(diào)節(jié)NMDAR-CaMKII-MAPKs信號通路、抗氧化應(yīng)激和抗線粒體凋亡有關(guān)。
【圖文】：

圖 1 當(dāng)歸及其活性成分的抗抑郁作用機(jī)制和其在抗抑郁復(fù)方中的貢獻(xiàn)Fig. 1Antidepressant mechanismof Radix Angelica sinensis and its active ingredients, and itscontribution to the compound prescription3 淺談“養(yǎng)血解郁”的科學(xué)內(nèi)涵抑郁癥患者不僅伴有心境低落、思維遲緩、意志活動減退等臨床癥狀，還存在心悸、胸悶、閉經(jīng)等軀體癥狀，表明抑郁癥常伴有心血不足、氣血不暢、心脈瘀阻等病征[66]。相關(guān)研究還表明抑郁癥常常并發(fā)貧血[67]和心血管疾病[68]。因此，抑郁癥與血液系統(tǒng)功能紊亂存在著密切的聯(lián)系。本文從中醫(yī)理論指導(dǎo)和現(xiàn)代科學(xué)研究的角度出發(fā)，綜述了抑郁癥與血液系統(tǒng)功能紊亂之間的聯(lián)系，進(jìn)而提出“養(yǎng)血解郁”理論，為抑郁癥的臨床治療提供新的策略。3.1 中醫(yī)理論指導(dǎo)3.1.1 郁癥與血液系統(tǒng)功能紊亂夫郁者，閉結(jié)、凝滯、瘀蓄、抑遏之總名也[69]。郁癥大多由于七情所傷，，情志

圖 2.1 當(dāng)歸對 CUMS 大鼠體重的影響re 2.1 Effect of CUMS on rats and therapeutic effect of Radix Angelicae Sinensis in body當(dāng)歸對 CUMS 大鼠糖水偏愛率的影響驗(yàn)各組大鼠糖水偏愛率統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表 2.2 所示。造模前，各組大鼠顯著性差異。造模第 21 天時(shí)，與空白組相比，CUMS 組大鼠糖水偏愛p＜0.01），說明模型組大鼠出現(xiàn)了快感缺失的癥狀。與模型組相比，著性升高，當(dāng)歸低劑量組與模型組具有顯著性差異（p＜0.05），文拉法劑量組、逍遙散組與模型組具有極顯著性差異（p＜0.01）。于造模 28組相比，各給藥組均具有極顯著性差異（p＜0.01）。表 2.2 當(dāng)歸對 CUMS 大鼠糖水偏愛率的影響（ x±s, n=12）le 2.2 Effect of CUMS on rats and therapeutic effect of Radix Angelicae Sinensis in the spreference test組別測試時(shí)間
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2652529