【摘要】：心肌肥大是啟動(dòng)心力衰竭的病理過(guò)程及心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要促進(jìn)因素。集中分布于線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Sigma-1受體(Sigma-1 receptor,Sig-1R)具有抗心肌肥大和心臟保護(hù)作用,可以減輕心肌肥大和功能障礙。一方面,Sig-1R可通過(guò)2型1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-triphate receptor type 2,IP3R2)與 2 型蘭尼堿受體(ryanodine receptor type2,RyR2)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+過(guò)載;另一方面,肌漿網(wǎng)向線粒體的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)有助于線粒體ATP生成,阻止心肌細(xì)胞肥大和凋亡。因此,Sig-1R在心肌細(xì)胞肥大與凋亡中扮演者重要的角色,值得我們探索和研究。中醫(yī)治療心力衰竭的重要思路-益氣活血法可以通過(guò)改善能量代謝,降低心肌細(xì)胞凋亡率、抑制心肌細(xì)胞肥大、延緩心室重構(gòu)等作用來(lái)改善心力衰竭。鑒于Sig-1R在心血管系統(tǒng)中的重要作用,及益氣活血方在治療心力衰竭疾病中的機(jī)理研究,我們假設(shè),益氣活血方可通過(guò)對(duì)Sig-1R的調(diào)節(jié)作用,調(diào)節(jié)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn),維持Ca2+穩(wěn)態(tài),改善線粒體的能量代謝和ATP生成,抑制心肌細(xì)胞肥大和凋亡的發(fā)生。目的:1.在培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞中,通過(guò)Sig-1R小干擾RNA(small interfering ribonucleic acid,siRNA)干預(yù),研究Sig-1R在心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中的作用機(jī)制。2.探討益氣活血方抑制心肌細(xì)胞肥大及凋亡的作用機(jī)制,是否與Sig-1R調(diào)節(jié)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn),改善線粒體能量代謝和細(xì)胞凋亡有關(guān)。方法:1.在培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞中,用血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)刺激,通過(guò)鬼筆環(huán)肽染色,倒置顯微鏡拍攝并測(cè)量細(xì)胞面積,觀察不同濃度AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞肥大的影響。2.在培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞中,通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Sig-1R siRNA,在mRNA水平抑制Sig-1R表達(dá)。同時(shí)用益氣活血方干預(yù)。細(xì)胞分為對(duì)照組[陰性對(duì)照siRNA(Negative control-siRNA,NCsiRNA)];模型組(AngⅡ10-7mol/L+NC siRNA);益氣活血方組(AngⅡ 10-7mol/L+益氣活血方0.1g/L+NC siRNA);益氣活血方+Sig-1R組(AngⅡ 10-7mol/L+益氣活血方0.1g/L+ Sig-1R siRNA基因沉默);Sig-1R組(Sig-1R siRNA基因沉默)。3.通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)Sig-1R的mRNA水平,確定轉(zhuǎn)染效率;Western Blot檢測(cè)Sig-1R與IP3R2的蛋白表達(dá)水平,確定Sig-1R在心肌肥大中的作用,及益氣活血方對(duì)Sig-1R表達(dá)的影響;通過(guò)鬼筆環(huán)肽染色及Tunel染色法確定心肌細(xì)胞肥大及凋亡情況;通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、線粒體膜電位及ATP的情況,反映益氣活血方對(duì)Ca2+調(diào)控及線粒體結(jié)構(gòu)與功能的保護(hù)作用。結(jié)果:1.不同濃度的AngⅡ刺激H9c2細(xì)胞48h。隨著AngⅡ濃度的增加,H9c2細(xì)胞面積呈增加趨勢(shì),其中Ang Ⅱ濃度為10-7mol/L時(shí),H9c2細(xì)胞面積較對(duì)照組顯著性增加(P0.05);AngⅡ濃度為10-6mol/L時(shí),細(xì)胞面積的增加開(kāi)始呈下降趨勢(shì);AngⅡ濃度為10-5mol/L時(shí),細(xì)胞面積低于對(duì)照組(P0.05)。2.與對(duì)照組比較,模型組心肌細(xì)胞中Sig-1R mRNA的表達(dá)量有降低趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;益氣活血方組與模型組比較,Sig-1R mRNA表達(dá)量有升高趨勢(shì),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;益氣活血方+sig-1R siRNA組和sig-1R siRNA組與對(duì)照組比較,Sig-1R mRNA的表達(dá)量均明顯降低(P0.01,P0.001);益氣活血方+sig-1R siRNA組與sig-1R siRNA組比較,Sig-1R mRNA表達(dá)量有升高趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;益氣活血方+sig-1R siRNA組與益氣活血方組比較,Sig-1R mRNA表達(dá)量明顯降低(P0.001)。與對(duì)照組比較,模型組心肌細(xì)胞中Sig-1R的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.01);與模型組比較,益氣活血方組Sig-1R的蛋白表達(dá)水平升高(P0.01);益氣活血方+sig-1R siRNA組與益氣活血方組比較,Sig-1R的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.001);益氣活血方+sig-1R siRNA組和sig-1R siRNA組與對(duì)照組比較,Sig-1R的蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P0.001)。鈣離子通道蛋白IP3R2在AngⅡ誘導(dǎo)后表達(dá)增加,給予益氣活血方顯著抑制其表達(dá)的增加(P0.01)。3.與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞面積明顯增大(P0.01),加益氣活血方干預(yù)后,與模型組比較,則顯著降低(P0.01);加Sig-1R siRNA抑制Sig-1R表達(dá)后,面積與模型組比較有降低趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞凋亡比例明顯升高(P0.01),Sig-1R siRNA組與對(duì)照組比較也出現(xiàn)較多凋亡(P0.05),但其凋亡比例比模型組少(P0.05);與模型組比較,加益氣活血方干預(yù)后,細(xì)胞凋亡比例則出現(xiàn)顯著降低(P0.01),轉(zhuǎn)染Sig-1R siRNA抑制Sig-1R表達(dá)后,益氣活血方改善凋亡的作用有所降低,但與模型組比較仍有顯著性差異(P0.05)。4.模型組胞漿Ca2+含量顯著升高(P0.01);加中藥干預(yù)后,組胞漿Ca2+含量降低(P0.05);Sig-1R siRNA干預(yù)后胞漿Ca2+含量也有所增高,但差異無(wú)顯著性。AngⅡ刺激后,與對(duì)照組比較,線粒體去極化水平明顯降低(P0.05),加入益氣活血方后,去極化有所改善,但無(wú)顯著性差異;加入Sig-1R siRNA干預(yù)后,與對(duì)照組比較,線粒體去極化水平明顯降低(P0.05),但與益氣活血方組比較,線粒體去極化水平改變不明顯。另外,與對(duì)照組比較,模型組與Sig-1R siRNA組ATP含量降低(P0.05);給予益氣活血方后,ATP含量有增加(P0.05),增加Sig-1R siRNA干預(yù)后,細(xì)胞中ATP含量有降低趨勢(shì)(P=0.090.05)。結(jié)論:1.AngⅡ 10-7mol/L刺激H9c2細(xì)胞48h,可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。2.AngⅡ誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞肥大的作用,與Sig-1R有關(guān);益氣活血方通過(guò)Sig-1R抑制AngⅡ誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞肥大。3.益氣活血方可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,其機(jī)制與Sig-1R及其信號(hào)通路有關(guān)。同時(shí),Sig-1R水平的降低可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。4.AngⅡ刺激心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中線粒體損傷明顯,益氣活血方對(duì)線粒體有一定的保護(hù)作用,其機(jī)制與Sig-1R有關(guān)。
【圖文】：

八叩１１濃度為１０＿７１１１0１／１時(shí)，冊(cè)0２細(xì)胞面積較對(duì)照組顯著性增加（八０．０５）；八叫１丨濃度為逡逑ｌ（Ｔ６ｍｏｌ／Ｌ時(shí)，細(xì)胞面積的增加開(kāi)始呈下降趨勢(shì)；Ａｎｇｌｌ濃度為ｌ（Ｔ５ｍｏｌ／Ｌ時(shí)，細(xì)胞面積低逡逑于對(duì)照組（巧0．邋０５）。見(jiàn)于表１－２，圖１－３。逡逑表卜２不同濃度Ａｎｇｌｌ處理４８ｈ后的細(xì)胞平均面積（叉士Ｓ）逡逑Ａｎｇｌｌ濃度（ｍｏｌ／Ｌ）邐ｎ邐像素值（尤士Ｓ）逡逑對(duì)照組（０）邐４邐７４５９．邋４９土８８３．邋７２逡逑１０－９邐４邐８４７２．７９邋±１６５８．６２逡逑１０＂８邐４邐８９９５．８３邋±１０３２．７８逡逑１０＇７邐４邐９２６０．９６邋±１１３２．９０＊逡逑１０—６邐４邐８０６６．８９±邋１１３０．０２逡逑１ＣＴ５邐４邐６６４６．邋１８±邋１２６３．８０逡逑注：與對(duì)照組比較，＊Ｋ0．邋０５。逡逑４２逡逑

３．邋１邋ｓｉＲＮＡ邋Ｓｉｇ－１Ｒ轉(zhuǎn)染時(shí)脂質(zhì)體用量的篩選逡逑跟據(jù)說(shuō)明書(shū)推薦用量范圍，篩選最適脂質(zhì)體濃度。首先用熒光標(biāo)記的ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染細(xì)逡逑胞，，結(jié)果如圖２－１所示。脂質(zhì)體７．邋５｜ｊ邋Ｌ與１０（Ｊ邋Ｌ時(shí)均有較多熒光標(biāo)記的ｓｉＲＮＡ進(jìn)入細(xì)逡逑胞，且組間沒(méi)有明顯差異。但用ＮＣ邋ｓｉＲＮＡ與Ｓｉｇ－１Ｒ邋ｓｉＲＮＡ分別轉(zhuǎn)染并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ｓｉｇ－ＩＲ逡逑ｍＲＮＡ表達(dá)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體為７．５ｐＬ，對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率更高，對(duì)Ｓｉｇ－１Ｒ的ｍＲＮＡ抑逡逑制作用更明顯（Ｐ＜0．邋００１）。見(jiàn)表２－２，圖２－２。逡逑■■逡逑■■逡逑圖２－１不同量脂質(zhì)體與熒光標(biāo)記的ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染細(xì)胞（２００Ｘ）逡逑注：ＡＢ分別為脂質(zhì)體７．５｜ｊＬ時(shí)的明場(chǎng)與熒光；ＣＤ分別為脂質(zhì)體ｌＯｐＬ時(shí)的明場(chǎng)與熒光。逡逑表２－２不同濃度脂質(zhì)體時(shí)ｓｉＲＮＡ邋Ｓｉｇ－ＩＲ千預(yù)后的Ｓｉｇ－ＩＲ邋ｍＲＮＡ擴(kuò)增結(jié)果（叉土Ｓ）逡逑組別邐ｎ邐（Ｘ士Ｓ）逡逑ＮＣ邋７．邋５（ｊ邋Ｌ邐３邐１．０１邋士邋０．邋１４逡逑ＳｉＲＮＡ邋７．５｜ｊ邋Ｌ邐３邐０．３５±０．０５＊＊＊逡逑ＮＣ邋１０｜Ｊ邋Ｌ邐３邐１．邋０７邋士邋０．邋５０逡逑ＳｉＲＮＡ邋１０｜Ｊ邋Ｌ邐３邐０．５６±０．０２逡逑５６逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2651381