【摘要】：目的:選取皖南地區(qū)眼鏡蛇蛇毒粗毒凍干粉,從中分離提純得到鎮(zhèn)痛活性組分(cobra venom analgesic factor,CVAF)探討其外用鎮(zhèn)痛的效應(yīng)及可能的作用機(jī)制,并對CVAF鎮(zhèn)痛的時間--效應(yīng)關(guān)系、劑量--效應(yīng)關(guān)系和CVAF用藥的耐受性及成癮性進(jìn)行初步研究。方法:1.CVAF的分離純化及分子量測定:采用SP-SephadexC-50陽離子交換層析技術(shù)和SephadexG-50分子排阻色譜分離提純出CVAF,以SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分子量測定。2.外用凝膠制備:將提純凍干的CVAF凍干粉,與凝膠基質(zhì)和防腐處理劑配制成調(diào)節(jié)酸堿度在6.5-7.0之間的外用凝膠制劑。3.CVAF的鎮(zhèn)痛效應(yīng)實(shí)驗(yàn):用完全弗氏佐劑對40只SD大鼠進(jìn)行炎癥模型造模,將實(shí)驗(yàn)分組分為5組:(1)生理鹽水對照組(NS組)、(2)完全弗氏佐劑炎痛組(CFA組)、(3)雙氯芬酸鈉鎮(zhèn)痛陽性對照組(CFA+SL組)、(4)氟比洛芬鎮(zhèn)痛陽性對照組(CFA+FB組)、(5)CVAF鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)組(CFA+CVAF組),分別采用熱刺痛儀和機(jī)械壓痛儀測定各組大鼠在用藥處理后每日的熱痛反應(yīng)時間和壓痛反應(yīng)所承受的重量,比較觀察眼鏡蛇毒活性組分CVAF凝膠局部外用處理后對各組大鼠熱痛和機(jī)械痛的影響。ELISA法檢測各組大鼠脊髓勻漿中IL-1、TNF-α的含量,HE染色法觀察大鼠足趾組織病理變化。4.CVAF的時間--效應(yīng)實(shí)驗(yàn):20只小鼠分為兩組;CVAF組和NS組,測定給藥前和給藥后30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h的熱痛反應(yīng)時間,觀察CVAF時間效應(yīng)關(guān)系。5.CVAF的劑量--效應(yīng)實(shí)驗(yàn):小鼠50只,分為5組。以LD50實(shí)驗(yàn)證明的藥物安全用藥劑量范圍為依據(jù)分別取1/8、1/6、1/4、1/3、1/2LD50五個劑量;即為0.08mg/Kg、0.1 mg/Kg、0.16mg/Kg、0.2mg/Kg、0.3mg/Kg,測定各組小鼠給藥前及給藥后2h的熱痛反應(yīng)時間,觀察CVAF的劑量效應(yīng)關(guān)系。6.CVAF的用藥耐受性實(shí)驗(yàn):30只小鼠,每組10只,隨機(jī)分為3組,:CVAF組(0.3mg/Kg)、嗎啡組(5mg/Kg)、NS(0.2ml/10g)組,選相同時間連續(xù)8天測定大鼠給藥前和給藥后2h后的熱痛反應(yīng)時間,觀察其對藥物的耐受性。7.CVAF用藥的成癮性實(shí)驗(yàn):24只小鼠,隨機(jī)分為3組,每組8只,CVAF組、嗎啡組、生理鹽水組,每天給藥2次(9:30、14:30),共3天。CVAF組腹腔注射6次劑量為0.1、0.2、0.2、0.3、0.3、0.4mg/Kg,總劑量為1.5mg/Kg,嗎啡組腹腔注射6次,6次的劑量依次為5、10、10、15、15和20mg/kg,總劑量為75mg/kg;生理鹽水組:腹腔注射生理鹽水,6次均為0.2ml/10g。最后一次給藥后2小時腹腔注射納洛酮6mg/kg,記錄各組出現(xiàn)戒斷癥狀的小鼠數(shù)量。結(jié)果:1.經(jīng)SP-SephadexC-50陽離子交換層析技術(shù)和SephadexG-50分子排阻色譜兩次分離后,凍干后得到皖南眼鏡蛇毒鎮(zhèn)痛活性組分干粉,SDS-PAGE電泳測定的CVAF分子量為6.5KDa。2.以CVAF制成的凝膠制劑為透明膠狀物,PH為在6.5-7.0之間。3.在鎮(zhèn)痛效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,對比各組大鼠體重發(fā)現(xiàn)CFA組大鼠體重增長最為緩慢,NS組體重增長較穩(wěn)定,而與CFA組比較CVAF鎮(zhèn)痛組大鼠在給藥后的第7日和第14日的體重差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05、P0.01)。從熱刺痛和機(jī)械壓痛實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn);從用藥的第4天起,CVAF鎮(zhèn)痛組的熱痛閾明顯高于CFA組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);CVAF組大鼠的機(jī)械壓痛閾與各組相比都有所提高,并明顯高于CFA組(P0.01);檢測脊髓勻漿中IL-1、TNF-α的濃度與CFA組相比濃度較低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),在HE染色中,CFA組大鼠的炎痛爪組織水腫明顯,顯微鏡下觀察可見中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤,而CVAF組大鼠足趾組織水腫明顯減輕,炎性浸潤相對不顯著。4.測定不同時間點(diǎn)的熱痛反應(yīng)時間比較發(fā)現(xiàn),CVAF從給藥0.5h后開始起效(P0.05),鎮(zhèn)痛作用一直延續(xù)到4h(P0.05),2h后熱痛反應(yīng)時間延長最明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。5.測定不同劑量在2小時后的熱痛反應(yīng)時間,其中0.1mg/Kg、0.2mg/Kg劑量組的熱痛反應(yīng)時間與基礎(chǔ)熱痛反應(yīng)時間相比均有所減少(P0.05),0.3mg/Kg劑量組與基礎(chǔ)熱痛反應(yīng)相比差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。6.在耐受性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)通過連續(xù)八天測得不同分組中各小鼠基礎(chǔ)痛閾發(fā)現(xiàn),與NS組相比較,CVAF鎮(zhèn)痛組的基礎(chǔ)痛閾在連續(xù)用藥的第4、6、7日差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。7.成癮性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)嗎啡用藥組8只小鼠都出現(xiàn)了戒斷癥狀及豎尾反應(yīng),而NS組和CVAF組小鼠均未出現(xiàn)上述反應(yīng)。結(jié)論:皖南地區(qū)眼鏡蛇毒活性組分CVAF相對分子量為6500Da,用其凍干粉制成的外用凝膠制劑,局部外用凝膠局部外用可提高炎痛大鼠熱痛閾和機(jī)械壓痛閾,其機(jī)制可能與減少炎癥介質(zhì)釋放,抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。CVAF小鼠腹腔注射最佳劑量為0.3mg/Kg,作用2小時鎮(zhèn)痛效果最佳,連續(xù)7天用藥后未發(fā)現(xiàn)耐受性,連續(xù)6次給藥未發(fā)現(xiàn)成癮性。
【圖文】：

圖 1.眼鏡蛇毒粗毒 SP-SephadexC-50 陽離子交換色譜圖Fig.1 CVAF separation and purification peak map, Ⅶ indicates the target peak

圖 1.眼鏡蛇毒粗毒 SP-SephadexC-50 陽離子交換色譜圖Fig.1 CVAF separation and purification peak map, Ⅶ indicates the target peak
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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