【摘要】：研究目的:癲癇(Epilepsy)是最常見的也是最嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。癲癇是一種以癲癇發(fā)作為特征的神經(jīng)障礙,是大腦異常放電的結(jié)果。癲癇的主要好發(fā)人群為兒童和老年人。據(jù)統(tǒng)計,約有50%的癲癇發(fā)生在兒童和老年人群中,而其中的一半發(fā)生在不滿一歲的嬰幼兒身上。在2015年,全世界約有3900萬人被診斷為癲癇,且導(dǎo)致1.25萬人死亡。目前該病的治療主要以藥物控制癲癇發(fā)作為主,并輔助以生活飲食的管理。但目前為止,還未能有一種理想的抗癲癇藥能夠有效地控制癲癇的發(fā)作,并不會對智力、興奮性能、運動功能、情緒或其它方面造成損傷�？紤]到傳統(tǒng)抗癲癇藥物的應(yīng)用局限性,以及其不可忽視的副作用,科學(xué)家們?nèi)孕璨粩嚅_發(fā)更為有效的且副作用相對較小的新型抗癲癇藥物。傳統(tǒng)中藥通常被認為是一種溫和而安全的草藥。傳統(tǒng)中藥是由天然植物萃取或合成的,其功效可代替人工合成的藥物。在中國,用中藥治療癲癇有著悠久的歷史。《中國藥典》中記載的具有抗癲癇功效的中草藥就有23種,包括:青陽參、黃芩、天麻、柴胡、黃連等。這些藥物被認為是治療癲癇的安全藥物,幾乎沒有發(fā)現(xiàn)有明顯的副作用。桔皮素(Tangeretin,分子式:C20H20O7;分子量:372.37)是一種O型聚甲氧基黃酮。其主要來源于蕓香科川橘(Citrus nobilis Lour.)的果皮、酸橙(C.aurantium L.)的果皮、以及柑橘(C.reticulata Blanco.)的葉和莖。桔皮素的多種生物活性作用已被廣泛報道,其中主要包括:增強胰島素的分泌,調(diào)節(jié)肝酶的活性,以及降低鏈球菌誘發(fā)的血糖升高。此外,桔皮素還具有顯著的抗炎抗氧化功能以及心血管和腎臟保護功能。近年來,有部分研究學(xué)者發(fā)現(xiàn),桔皮素亦具有一定的神經(jīng)保護作用,其可用于阿爾茨海默癥和帕金森綜合征的預(yù)防和治療。但據(jù)我們所知,目前桔皮素對于癲癇的作用仍未被廣泛研究。本實驗研究了桔皮素對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷的作用,同時檢測了神經(jīng)元中凋亡蛋白和金屬基質(zhì)蛋白表達的變化。本文旨在分析桔皮素對于癲癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用,以及探尋其深層的分子機制,為闡明桔皮素的抗癲癇機制提供一定的理論依據(jù)。實驗方法:第一部分桔皮素對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響本實驗使用清潔級成年雄性Wistar大鼠30只,分為5組(n = 6每組):正常對照組(Control),癲癇模型組(Pilocarpine,PL),桔皮素低劑量治療組(PL+ 50mgTangeretin),桔皮素中劑量治療組(PL + 100mgTangeretin),和桔皮素高劑量治療組(PL+200mgTangeretin)。其中,癲癇模型組中大鼠腹腔注射3 mmol/kg氯化鋰進行預(yù)處理,24 h后皮下注射1 mg/kg氫溴酸東苠菪堿(避免匹魯卡品引起的外周膽堿能反應(yīng)),30min后腹腔注射30mg/mL匹魯卡品。桔皮素治療組大鼠腹腔注射3 mmol/kg氯化鋰進行預(yù)處理,24 h后腹腔注射50 mg、100 mg或200 mg桔皮素,30 min后皮下注射1 mg/kg氫溴酸東莨菪堿,30 min后腹腔注射30 mg/mL匹魯卡品。經(jīng)過處理的大鼠海馬組織被分離。我們對海馬組織進行脫水、石蠟包埋以及切片,用于Nissl染色以及末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記測定(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)。第二部分桔皮素通過調(diào)控凋亡蛋白表達及PI3K/AKT通路抑制氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠神經(jīng)元的凋亡經(jīng)過處理的大鼠海馬組織從大鼠體內(nèi)分離后,利用RIPA裂解液對海馬組織總蛋白進行提取。并用核蛋白抽提試劑盒和線粒體蛋白抽提試劑盒分別對海馬組織核蛋白和線粒體蛋白進行提取。利用western blot方法檢測各蛋白抽提液中凋亡相關(guān)蛋白以及PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達變化。第三部分桔皮素抑制氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠神經(jīng)元中金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達利用Trizol試劑提取海馬組織中總RNA。應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測海馬組織中MMP-2與MMP-9的基因表達變化。同時,利用western blot和明膠酶譜分析法檢測組織中MMP-2與MMP-9蛋白表達水平以及活性。結(jié)果:第一部分桔皮素對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響Control組的Wistar大鼠無任何癲癇發(fā)作癥狀,其它四組的大鼠均有不同程度的癲癇發(fā)作癥狀。與PL組相比,桔皮素治療明顯的降低了大鼠癲癇發(fā)作程度。PL組癲癇首次發(fā)作的潛伏期為11.02 ± 1.50 min,而PL + 50 mg Tangeretin組為18.15±1.45 min,PL + 100 mg Tangeretin 組為 25.2 ± 2.05 min,PL+ 200 mg Tangeretin組為33.5±1.20 min,桔皮素治療明顯延長了大鼠首次癲癇發(fā)作的潛伏期。PL組大鼠達到IV級發(fā)作的潛伏期為34.10 ± 1.50 min,而桔皮素治療組同樣延長了大鼠癲癇Ⅳ級發(fā)作的潛伏期。PL + 50 mgTangeretin組潛伏期為41.15 ±1.25 min,PL + 100 mg Tangeretin 組為 48.20 ± 2.05 min,PL + 200 mg Tangeretin組為50.5 ±1.20 min。此外,與PL組相比,桔皮素治療顯著的降低了大鼠的死亡率(p0.05)。通過Nissl染色實驗,我們觀察到Control組海馬wCA3區(qū)神經(jīng)元呈現(xiàn)帶狀分布,錐體細胞及顆粒細胞排列緊密,結(jié)構(gòu)清晰完整,形態(tài)正常,胞核呈圓形或橢圓形。PL處理組海馬神經(jīng)元間距明顯增大,排列疏松,細胞腫脹,輪廓模糊,界限不清,部分神經(jīng)元胞體皺縮,出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元損傷情況。而桔皮素治療明顯降低了海馬神經(jīng)元損傷情況。各組大鼠海馬神經(jīng)元CA3區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)目結(jié)果顯示,PL組大鼠CA3區(qū)神經(jīng)元存活的數(shù)目明顯低于Control組。然而,桔皮素治療組大鼠CA3區(qū)神經(jīng)元存活的數(shù)目明顯高于PL組(p0.05)。TUNEL染色結(jié)果顯示,PL處理組中海馬CA3區(qū)TUNEL陽性細胞顯著高于Control組。桔皮素治療組中TUNEL陽性細胞明顯低于PL處理組,且呈濃度依賴性(p0.05)。第二部分桔皮素通過調(diào)控凋亡蛋白表達及PI3K/AKT通路抑制氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠神經(jīng)元的凋亡Western blot 結(jié)果顯示,PL 組中 Bad、Bax 以及 Cleaved-caspase-3 的蛋白表達水平明顯高于其在Control組的蛋白表達,而Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表達水平明顯降低(p0.05)。然而,與PL組相比,桔皮素治療組明顯增加了 Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表達水平,但是降低了 Bad、Bax和Cleaved-caspase-3的蛋白表達水平(p0.05)。凋亡相關(guān)因子蛋白的表達水平的升高與降低受桔皮素濃度的影響,呈濃度依賴性。PL組中海馬組織細胞核中的凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor,AIF)的蛋白表達水平明顯高于Control組,而海馬組織線粒體中的AIF蛋白表達水平明顯低于Control組。相較于PL組,桔皮素治療組海馬組織細胞核中的AIF蛋白表達水平明顯降低,而線粒體中的AIF蛋白表達水平明顯升高。PL +200 mg Tangeretin處理組的變化最為明顯。磷酸化的AKT和GSK-3β蛋白表達水平在PL組中明顯降低,而AKT的負調(diào)控因子磷酸酯酶(phatase and tensin homology deleted on chromosome 10,PTEN)的蛋白表達水平顯著升高。此外,AKT的下游靶蛋白mTORcl和cyclinD1的蛋白表達水平在PL組明顯下調(diào)(p0.05)。然而,與PL組相比,桔皮素治療組明顯上調(diào)了磷酸化的AKT和GSK-3β以及mTORcl和cyclinD1的蛋白表達水平,但是降低了 PTEN的蛋白表達水平,這些變化呈濃度依賴性(p0.05)。第三部分桔皮素抑制氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠神經(jīng)元中金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達熒光定量PCR電泳結(jié)果顯示,匹魯卡品注射12h后,PL組中MMP-2和MMP-9的mRNA表達水平與Control組相比變化不明顯。桔皮素治療組中MMP-2的mRNA表達水平與PL組相比無明顯的趨勢變化,但是MMP-9的mRNA表達水平明顯高于PL處理組。匹魯卡品注射24h后,PL組中MMP-2和MMP-9的mRNA表達水平明顯高于Control組,而桔皮素治療組中MMP-2和MMP-9 mRNA的表達水平與PL組相比無明顯變化。Western blot實驗結(jié)果顯示,匹魯卡品注射12 h后,PL組中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯升高,而桔皮素治療組中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平顯著下降。同樣地,匹魯卡品注射24h后,MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平在PL處理組明顯上調(diào),而在桔皮素治療組明顯下調(diào)。此外,MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平在不同組處理12 h后的變化明顯高于處理24 h后的變化。明膠酶譜實驗結(jié)果顯示,與Control組相比,在匹魯卡品注射12 h后,PL組中MMP-2和MMP-9的活性明顯增強(p0.05)。而與PL組相比,桔皮素治療組中MMP-2和MMP-9的活性明顯降低(p0.05)。在匹魯卡品注射24 h后,桔皮素治療組中MMP-2和MMP-9的活性與上述結(jié)果類似,PL組MMP-2和MMP-9的活性顯著升高,不同濃度桔皮素處理組MMP-2和MMP-9的活性明顯降低。結(jié)論:1.桔皮素能夠有效延緩氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期,降低致癇大鼠的死亡率;2.桔皮素能夠減輕氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元的損傷,并且抑制海馬神經(jīng)元凋亡;3.桔皮素通過降低AIF核轉(zhuǎn)位并激活PI3K/AKT信號通路,保護大鼠海馬神經(jīng)元;4.桔皮素能夠降低氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬組織中MMP-2和MMP-9的表達和活性,緩解癲癇的癥狀。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2650530