【摘要】：中藥中常見的真菌毒素主要有黃曲霉毒素(aflatoxins,AFs)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)、伏馬菌素(fumonisins,FBs)、T-2毒素等。其中AFs與OTA是中藥中較易污染的真菌毒素兩者都屬于人類致癌物,嚴(yán)重威脅著用藥安全性。因此,針對常見中藥材中真菌毒素的定量化檢測及防霉變控制技術(shù)的研究至關(guān)重要。本論文主要研究:1.IAC-HPLC-FLD方法測定5種典型中藥飲片中黃曲霉毒素采用IAC-HPLC-FLD方法,樣品經(jīng)70%甲醇提取、免疫親和柱凈化后,利用液相色譜分離-熒光檢測中藥飲片中4種黃曲霉毒素(AFB_1,AFB_2,AFG_1和AFG_2)的含量。通過優(yōu)化前處理方法,使得此方法能同時(shí)滿足5種中藥飲片遠(yuǎn)志、柏子仁、決明子、黨參、薏苡仁的檢測要求。收集并檢測5種中藥飲片114批次,其中26批柏子仁(AFs 1.22~46.67μg·kg~(-1),AFB_1 1.22~31.40μg·kg~(-1))、4批薏苡仁(AFs 1.97~41.13μg·kg~(-1),AFB_1 1.97~36.40μg·kg~(-1))、1批決明子(AFs 13.65μg·kg~(-1),AFB_1 12.60μg·kg~(-1))檢出陽性、黨參未檢出、13批遠(yuǎn)志(AFs 2.40~194.46μg·kg~(-1),AFB_1 2.03~90.04μg·kg~(-1)),陽性率為41%,超標(biāo)率為15%。2.遠(yuǎn)志初加工過程中黃曲霉毒素易發(fā)生關(guān)鍵環(huán)節(jié)的考察及脫除越來越多的研究報(bào)道出遠(yuǎn)志中黃曲霉毒素污染嚴(yán)重,但對其產(chǎn)生毒素的關(guān)鍵點(diǎn)及防霉變控制方面的研究較少。本章通過實(shí)地考察山西產(chǎn)地的遠(yuǎn)志的初加工過程,同時(shí)于實(shí)驗(yàn)室簡單模擬遠(yuǎn)志產(chǎn)地初加工過程,包括埋土、發(fā)汗、抽芯等過程,檢測在初加工的各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)下黃曲霉毒素B_1,B_2,G_1,G_2的產(chǎn)生狀況;并將由初加工得到的遠(yuǎn)志飲片在28℃,濕度范圍為82%~90%和96%條件下分別進(jìn)行儲藏后一段時(shí)間后,測定毒素產(chǎn)生的情況,以此考察遠(yuǎn)志初加工-儲藏過程中黃曲霉毒素的易污染環(huán)節(jié)。檢測結(jié)果顯示,遠(yuǎn)志在初加工各環(huán)節(jié)的樣品檢測結(jié)果均為陰性;其次2種濕度條件下儲藏結(jié)果顯示,當(dāng)濕度為96%時(shí),在7天的時(shí)間內(nèi)遠(yuǎn)志發(fā)霉嚴(yán)重,并檢測出了AFB_1、AFs的含量分別為4.01μg·kg~(-1),5.36μg·kg~(-1)。因此,將采收的遠(yuǎn)志鮮品進(jìn)行及時(shí)處理和干燥,對遠(yuǎn)志真菌毒素污染的防控至關(guān)重要。以黃曲霉毒素含量高于限量(14號樣品AFs,AFB_1分別為159.44,68.66μg·kg~(-1))與與低于限量(39號樣品AFs,AFB_1分別為2.08,2.08μg·kg~(-1))的2個(gè)批次遠(yuǎn)志分別為進(jìn)行黃曲霉毒素脫除研究。首先測定了在水洗及75%乙醇洗2種脫除方法下遠(yuǎn)志中黃曲霉毒素含量的變化,結(jié)果表明14號遠(yuǎn)志樣品進(jìn)行水洗和75%乙醇洗后對AFB_1的脫除率分別為92.47%和64.01%;39號樣品在水洗和75%乙醇洗后,黃曲霉毒素未檢出,對AFB_1的脫除率均為≤100%。其次測定了由飲片到顆粒劑的過程中毒素含量的變化,測得39號遠(yuǎn)志中AF_S和AFB_1,分別為60.61和11.97μg·kg~(-1),轉(zhuǎn)移率分別為38.01%,17.43%;39號遠(yuǎn)志中未檢出黃曲霉毒素,其轉(zhuǎn)移率約為ND。3.柏子仁初加工過程中黃曲霉毒素易發(fā)生關(guān)鍵環(huán)節(jié)的考察及脫除中藥柏子仁中毒素的脫毒是指采用物理、化學(xué)、生物等處理方法除去已受到污染的中藥材表面或內(nèi)部的毒素,中藥在產(chǎn)地加工儲藏中有效的監(jiān)控將避免真菌毒素成為威脅人類健康的污染源。本章通過模擬柏子仁產(chǎn)地初加工過程,考察在不同初加工條件下各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)下AFB_1,AFB_2,AFG_1,AFG_2的產(chǎn)生狀況。結(jié)果表明模擬過程中的柏子仁未成品(處于初加工過程中某個(gè)環(huán)節(jié)的產(chǎn)品)未檢出AFs,說明此加工過程不易被毒素污染。此外收集的隔年柏子仁未成品及柏子仁成品中AFs檢測結(jié)果均超過限量,污染嚴(yán)重,說明藥材基地在初加工的過程中,存在在得到柏子之前就已經(jīng)被毒素污染或在儲藏柏子的過程中被毒素污染這兩種情況,更進(jìn)一步說明了對中藥加工初始環(huán)節(jié)監(jiān)控的重要性。選取黃曲霉毒素毒素含量高于限量和低于限量的2個(gè)批次柏子仁樣品(AFs,AFB_1毒素初始含量分別為23.95和23.17μg·kg~(-1)(1號樣品);3.94和3.94μg·kg~(-1)(2號樣品))進(jìn)行進(jìn)一步毒素脫除實(shí)驗(yàn),測定在水洗及75%乙醇洗2種脫除方法下,比較被AFs污染的柏子仁中毒素含量的變化,得到1號樣品進(jìn)行水洗和75%乙醇洗后對AFB_1的脫除率分別為77.69%和≤100%,對AFs的脫除率分別為78.41%和≤100%;2號樣品在水洗和75%乙醇洗后,2種脫除方式均無黃曲霉毒素檢出,對AFB_1、AFs的脫除率均為≤100%。4.OTA免疫試紙條的制備及簡單應(yīng)用以膠體金標(biāo)記抗體作為探針,通過優(yōu)化金標(biāo)抗體的偶聯(lián)比、重懸液體系、C線與T線濃度等條件,自組裝基于競爭法原理檢測OTA的膠體金免疫試紙條�？贵w加入量為5μg,10 mM PBS(1%蔗糖,0.02%MgSO_4,0.1%Tween 20)的重懸溶液體系下,采用NC140硝酸纖維素膜,肉眼檢測限為2.5μg·mL~(-1),檢測時(shí)間10~20 min。并采用70%甲醇-水提取收集的中藥材樣品,探討膠體金試紙條在不同中藥基質(zhì)下的測定影響,檢測方法滿足歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)15μg·kg~(-1)的要求。同時(shí)液質(zhì)確證了免疫層析分析方法樣品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【圖文】：

稀釋 3 倍，白芨經(jīng) 60 %甲醇提取，稀釋 4 倍，白芷以 70 %甲 4 倍可獲得優(yōu)異的檢測靈敏度，為了克服基質(zhì)、pH 干擾，獲得準(zhǔn)確的紙條應(yīng)用于不同中藥基質(zhì)需采用適宜的樣品制備方案。與 ELISA 法相測卡檢測法更輕巧省功、方便攜帶，然而膠體金在試紙條上呈現(xiàn)的是淡景干擾掩蔽其顏色變化影響主觀判斷，且裸眼觀測試紙條只能達(dá)到定性，無法滿足定量檢測需求，為了克服此類難題，研究者嘗試通過改變標(biāo)利用儀器辨別的方式等改善結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度。武會娟等[38]開發(fā)了磁性免疫層析試劑盒（包括試紙條和超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記 AFB1抗體結(jié)合在超順磁微粒上的目標(biāo)物來定量檢測生物樣品中 AFB1水平。王艷料作為標(biāo)記物，示蹤待測物水平，該法檢測限低至 0.1～0.3 ng·mL 1，.3～4 ng·mL 1。Urusov A E[40]采用二次標(biāo)記抗體放大顯色標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)該倍的目的（見圖 1.1）。基于磁性復(fù)合粒子、金磁納米以及二次放大模式度可達(dá)到 ELISA 水平，通過改善標(biāo)記物能顯著改善傳統(tǒng)金納米免疫層應(yīng)對復(fù)雜基質(zhì)中痕量檢測的需求，放寬樣品前處理制備條件，降低樣品，尤其適合中藥樣品的檢測，此類方法有望在中藥 AFB1有待嘗試。

圖 1.1 混合對照品溶液（A）、決明子陽性樣品（B）、薏苡仁陽性樣品（C）、黨參陰性樣品（D）、柏子仁陽性樣品（E）、遠(yuǎn)志陽性樣品（F）的 HPLC 圖Fig. 1.1 Chromatograms of reference substances solution (A), cassia positive sample(B), coixseed positive sample (C), codonopsis negative sample(D), platycladi seed positive sample (E) 、Polygalae Radix positive sample (F)1.3.2 線性關(guān)系取 AFG2，AFG1，AFB2，AFB1混合對照品儲備液，用甲醇-水（50：50）配制成一系列濃度的混合對照品溶液（AFG1，AFB1濃度：0.25，0.5，1，2.5，5，10，25 μg·L-1；AFG2，AFB2濃度：0.0625，0.125，，0.25，0.625，1.25，2.5，6.25 μg·L-1），分別進(jìn)樣 10 μL，記錄色譜圖，并記錄濃度與峰面積的參數(shù)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算 4 組成分的回歸方程分別為：y=50215 x+1435.1；y=23159 x+1424.6；y=81614 x+759.41；y=36325 x+192.24，其中 AFG2和 AFB2在 0.0625～6.25 μg·L-1范圍內(nèi)，AFG1和 AFB1在 0.25～25 μg·L-1范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù) R2均大于 0.9996。1.3.3 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取供試品藥材粉末(過 2 號篩)5 g，加入混合對照品溶液，按 2.2 項(xiàng)下方法制備
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R284;O652

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本文編號：2650528