發(fā)布時間：2020-05-05 15:50

【摘要】：中華大蟾蜍(Bufo Gargarizans)屬于脊索動物門(Chordata)、脊椎動物亞門(Vertebrata)、兩棲綱(Amphibia)、無尾目(Anura)、蟾蜍科(Bufonidae)、蟾蜍屬(Bufo)動物,是珍貴的藥用動物。生物活性肽因?yàn)槠渚哂袑ι鼨C(jī)體功能發(fā)揮著重要的作用,因而在世界范圍內(nèi)成為探索的熱點(diǎn)之一。本研究是以中華大蟾蜍為研究對象,主要對蟾蜍皮應(yīng)用酶解法制備活性肽并進(jìn)行抗氧化和抗菌方面的藥理研究。本論文研究內(nèi)容主要如下:1、蟾蜍皮酶解條件優(yōu)化及理化性質(zhì)研究:對中華大蟾蜍使用酶解法提取活性肽,優(yōu)化酶解條件,并對通過酶解法提取到的活性肽進(jìn)行理化性質(zhì)的研究。試驗(yàn)結(jié)果表明酶解法能夠從蟾皮中獲得活性肽,酶解產(chǎn)物命名為W_1。通過比較堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶與中性蛋白酶五種蛋白酶對蟾蜍皮的水解度確定最佳水解酶是中性蛋白酶。使用中性蛋白酶進(jìn)行時間、底物濃度和E/S單因素和正交試驗(yàn),得出最佳酶解工藝條件為水解時間4h,底物濃度6%,E/S為15%。粗提物W_1經(jīng)Tricine-SDS-PAGE測定,結(jié)果顯示蟾蜍皮膚活性肽粗提物分子量集中在10KDa以下。2、蟾蜍皮酶解肽分離及抗氧化性研究:試驗(yàn)采用Sephadex—G50凝膠過濾色譜法對蟾蜍皮活性肽粗提物W_1進(jìn)行分離純化,對分離得到的組分進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)以及氨基酸成分研究。分離結(jié)果得到F_1、F_2兩種組分。比較兩種組分對DPPH·、ABTS~+·、·OH的清除作用和還原力強(qiáng)弱。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)各種方法測定的抗氧化結(jié)果F_2均高于F_1,其中F_1、F_2對DPPH·最大清除率都接近100%,IC50分別為2.24mg/mL與1.004mg/mL;F_1、F_2對ABTS~+·最大清除率也都接近100%,IC50分別為1.94mg/mL與1.13mg/mL;F_1、F_2對·OH最大清除率都達(dá)到了80%以上,IC50分別為0.73mg/mL與0.63mg/mL;其還原力測定結(jié)果證實(shí)了F_1與F_2都有很強(qiáng)的抗氧化性,并且F_2的還原力高于F_1。氨基酸分析結(jié)果表明F_1和F_2各有17種氨基酸,其中F_1和F_2含有的疏水性氨基酸有丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸以及異亮氨酸;F_2中含有的疏水性氨基酸濃度均高于F_1中對應(yīng)的氨基酸;從必需氨基酸角度看,F_1與F_2中含有亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸,并且除了蛋氨酸外,其他幾種必需氨基酸濃度F_2均明顯高于F_1對應(yīng)的必需氨基酸。3、蟾蜍皮酶解肽抗菌性研究:試驗(yàn)采用金黃色葡萄球菌與大腸桿菌分別作為革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的代表菌種,以卡那霉素作為陽性對照,無菌水作為陰性對照,測定F_1、F_2兩種組分的抑菌性研究。結(jié)果表明F_2對金黃色葡萄球菌抑制效果較強(qiáng),對大腸桿菌抑菌作用相對較弱,而F_1對金黃色葡萄球菌的抑菌作用遠(yuǎn)不及F_2,對大腸桿菌并未發(fā)現(xiàn)抑制作用;對F_2進(jìn)行兩種菌的最低抑菌濃度測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)F_2對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為15.63μg/mL,對大腸桿菌的最低抑菌濃度為250μg/mL,相對較高。
【圖文】：

55 8.0 50 7.0 37 1.8 50 7.5 50 7.0 采用茚三酮法測定水解度。作 首先取 0.5g 水合茚三酮、11.26 g Na2H置成茚三酮顯色劑。取甘氨酸用蒸餾水將釋成為 2，4，6，10，15 和 20μg/mL 不同濃別加入 1mL 配好的茚三酮顯色劑，煮沸 15乙醇溶液，充分混勻，，避光 15min，使用紫甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1.1 所示�；诟拾彼酦H2的濃度公式 C = 0.259A+0.008。的濃度（mmoL/L），A 為吸光度。

3%C —— 0.407mL 1. 6%C 1.50mL —— 沖液 1.50mL 0.667mL 0. 0.48mL —— 1.8g —— O 1.02mL 0.926mL 1.膠凝固劑 40μL 20μL ED 5μL 3μL 分析白酶酶解蟾蜍皮的水解度結(jié)果解蟾蜍皮法的五種蛋白酶的水解度如圖 1.2 所示，從圖中可以看具有最高程度的水解作用，其次是胰蛋白酶，堿性蛋白酶和胃蛋酶，水解度接近 0%，所以選擇中性蛋白酶作為蟾蜍皮水解的蛋白
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R284.2;R285

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周釩;楊屆;;蟾蜍的藥用價值研究進(jìn)展[J];湖南中醫(yī)雜志;2015年11期

2 李加興;陳選;鄧佳琴;吳越;劉玲玲;涂媛;周炎輝;;黃秋葵黃酮的提取工藝和體外抗氧化活性研究[J];食品科學(xué);2014年10期

3 付英杰;侯林;李艷芝;田景振;;Tricine-SDS-PAGE法對阿膠的酶解物鑒別[J];中成藥;2013年10期

4 秦垂新;姚松君;唐青濤;李德靈;鄭志娟;李文治;;抗氧化肽及其化學(xué)活性測定方法的研究概述[J];食品工業(yè)科技;2014年01期

5 孟慶煥;王化;王洪政;吳薇薇;鐘晨;祖元剛;;牡丹種皮黃酮提取及對ABTS自由基清除作用[J];植物研究;2013年04期

6 李洋;馬文平;倪志婧;;寧夏枸杞體外抗氧化機(jī)理研究[J];食品科學(xué);2014年01期

7 張銳昌;王綺;張應(yīng)龍;徐志宏;;Tricine-SDS-PAGE測定小麥蛋白酶解物分子量分布[J];食品研究與開發(fā);2012年12期

8 洪軍;胡建業(yè);;陽離子抗菌肽的殺菌及抗藥性機(jī)制的研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2012年11期

9 李維;蘭海楠;郭風(fēng);趙雪;付志玲;楊艷紅;劉禹;吳天成;鄭鑫;;生物活性肽的研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2012年10期

10 陳雯;葉書培;李秋燕;陳愛樂;趙紫扦;何蕾;鄭榮泉;;兩棲類動物抗菌肽對病原微生物作用研究進(jìn)展[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年16期

相關(guān)會議論文 前1條

1 賴仞;李建許;;兩棲動物皮膚抗感染多肽組學(xué)研究[A];第八屆中國生物毒素學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 趙瑞利;牛蛙（Rana catesbeiana）皮膚活性肽的分子克隆及其生物學(xué)活性研究[D];吉林大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前8條

1 李梁;東北林蛙皮膠原蛋白理化性質(zhì)及膠原多肽活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 楊富敏;酶解海灣扇貝裙邊制備抗菌肽的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 劉華;虎紋蛙皮膚分泌物活性肽的分離純化及表征[D];福州大學(xué);2013年

4 范譯文;野生黑斑蛙皮膚抗菌多肽的分離純化及活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

5 蔡紅燕;燕麥油的提取、抗氧化活性及應(yīng)用研究[D];武漢工業(yè)學(xué)院;2012年

6 王劍;黑斑蛙皮膚生物活性肽的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性檢測[D];遼寧師范大學(xué);2011年

7 徐佳佳;特定細(xì)菌脅迫下東北林蛙（Rana dybowskii）皮膚抗菌肽分泌的動態(tài)變化[D];東北林業(yè)大學(xué);2010年

8 李俊峰;中國林蛙皮膚生物活性肽的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性檢測[D];遼寧師范大學(xué);2009年

本文編號：2650389