【摘要】：目的從胰島素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路探討丹瓜方含藥血清調(diào)控胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖脂代謝紊亂的作用機(jī)制,為糖尿病的基礎(chǔ)研究及中醫(yī)治療服務(wù)。方法1、用含0.25 mmol/L軟脂酸的低糖DMEM培養(yǎng)液體外干預(yù)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24h建立IR模型,通過葡萄糖氧化酶法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖殘余量,計(jì)算胰島素敏感指數(shù)驗(yàn)證造模是否成功。2、將實(shí)驗(yàn)分為5組:空白對照組、高脂組、丹瓜方1組、高糖高脂組、丹瓜方2組,根據(jù)分組情況每組給予相應(yīng)誘導(dǎo)液體外干預(yù)24h。用葡萄糖氧化酶法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖殘余量并計(jì)算各組細(xì)胞糖耗量及胰島素敏感指數(shù),糖原試劑盒檢測各組細(xì)胞糖原含量,HE染色觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化,油紅O染色觀察各組細(xì)胞脂質(zhì)堆積情況,TC、TG試劑盒檢測各組細(xì)胞TC、TG含量,qPCR法檢測各組細(xì)胞InsR、IRS-1、SH2B2、IGF-1、PRKAA2和PTPN1 mRNA表達(dá)量,Western Blot法檢測各組細(xì)胞InsR、IRS-1、SH2B2蛋白表達(dá)量,ELISA法檢測各組細(xì)胞瘦素蛋白表達(dá)量。結(jié)果1、模型建立:用含0.25 mmol/L軟脂酸的低糖DMEM培養(yǎng)液體外干預(yù)HepG2細(xì)胞24 h后,葡萄糖氧化酶法測定結(jié)果顯示,模型組細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯降低(P0.05),胰島素敏感性減弱(P0.05),提示IR-HepG2細(xì)胞模型成功建立。2、細(xì)胞活力:CCK8法檢測結(jié)果顯示,空白對照組、高脂組、丹瓜方1組、高糖高脂組、丹瓜方2組之間細(xì)胞活力無明顯差異(P0.05)。3、葡萄糖消耗量與胰島素敏感指數(shù):與空白對照組相比,高脂組細(xì)胞葡萄糖消耗量減少(P0.05),胰島素敏感指數(shù)降低。與高脂組相比,丹瓜方1組細(xì)胞葡萄糖消耗量增加(P0.05),胰島素敏感指數(shù)提高(P0.05);高糖高脂組細(xì)胞葡萄糖消耗量減少(P0.05),胰島素敏感指數(shù)降低(P0.05);與高糖高脂組相比,丹瓜方2組細(xì)胞葡萄糖消耗量增加(P0.05),胰島素敏感指數(shù)提高(P0.05)。4、糖原含量:與空白對照組相比,高脂組細(xì)胞糖原含量減少(P0.05);與高脂組相比,丹瓜方1組細(xì)胞糖原含量增加(P0.05),高糖高脂組細(xì)胞糖原含量減少(P0.05);與高糖高脂組相比,丹瓜方2組細(xì)胞糖原含量增加(P0.05)。5、TC含量:與空白對照組相比,高脂組細(xì)胞TC含量增加(P0.05);與高脂組相比,丹瓜方1組細(xì)胞TC含量減少(P0.05),高糖高脂組細(xì)胞TC含量增加(P0.05);與高糖高脂組相比,丹瓜方2組細(xì)胞TC含量減少(P0.05)。6、TG含量:與空白對照組相比,高脂組細(xì)胞TG含量增加(P0.05);與高脂組相比,丹瓜方1組細(xì)胞TG含量減少(P0.05),高糖高脂組細(xì)胞TG含量增加(P0.05);與高糖高脂組相比,丹瓜方2組細(xì)胞TG含量減少(P0.05)。7、油紅O染色:與空白對照組相比,高脂組細(xì)胞內(nèi)脂滴增多;與高脂組相比,丹瓜方1組細(xì)胞內(nèi)脂滴有所減少,高糖高脂組細(xì)胞內(nèi)脂滴則有所增多且較為密集;與高糖高脂組比較,丹瓜方2組細(xì)胞內(nèi)脂滴也相應(yīng)減少。8、HE染色:與空白對照組相比,高脂組細(xì)胞出現(xiàn)一定程度變形、細(xì)胞質(zhì)染色變淺;與高脂組相比,丹瓜方1組細(xì)胞形態(tài)有所改善、細(xì)胞質(zhì)染色變淺程度減輕,高糖高脂組細(xì)胞變形程度加重、細(xì)胞質(zhì)染色變淺程度也更明顯;與高糖高脂組比較,丹瓜方2組細(xì)胞形態(tài)也有所改善、細(xì)胞質(zhì)染色變淺程度減輕。9、qPCR:與空白對照組相比,高脂組細(xì)胞InsR、IRS-1、SH2B2、IGF-1、PRKAA2mRNA表達(dá)量降低(P0.05),PTPN1 mRNA表達(dá)量升高(P0.05)。與高脂組相比,丹瓜方1組的InsR、IRS-1、SH2B2、IGF-1 mRNA表達(dá)量升高(P0.05),PRKAA2 mRNA表達(dá)量升高(P0.05),PTPN1 mRNA表達(dá)量降低(P0.05);高糖高脂組的InsR、IRS-1、SH2B2、IGF-1 mRNA表達(dá)量降低(P0.05),PRKAA2 mRNA表達(dá)量降低(P0.05),PTPN1 mRNA表達(dá)量升高(P0.05)。與高糖高脂組相比,丹瓜方2組的InsR、IRS-1、SH2B2、IGF-1mRNA表達(dá)量升高(P0.05),PRKAA2 mRNA表達(dá)量升高(P0.05),PTPN1 mRNA表達(dá)量降低(P0.05)。10、Western Blot:與空白對照組相比,高脂組細(xì)胞InsR、IRS-1、SH2B2蛋白表達(dá)量降低(P0.05);與高脂組相比,丹瓜方1組細(xì)胞InsR、IRS-1、SH2B2蛋白表達(dá)量升高(P0.05),高糖高脂組細(xì)胞InsR、IRS-1、SH2B2蛋白表達(dá)量降低(P0.05);與高糖高脂組相比,丹瓜方2組細(xì)胞InsR、IRS-1、SH2B2蛋白表達(dá)量升高(P0.05)。11、ELISA:與空白對照組相比,高脂組細(xì)胞瘦素蛋白表達(dá)量升高(P0.05);與高脂組相比,丹瓜方1組細(xì)胞瘦素蛋白表達(dá)量降低(P0.05),高糖高脂組細(xì)胞瘦素蛋白表達(dá)量升高(P0.05);與高糖高脂組相比,丹瓜方2組細(xì)胞瘦素蛋白表達(dá)量降低(P0.05)。結(jié)論1、高糖能在高脂誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上增加HepG2細(xì)胞內(nèi)糖脂代謝紊亂,加劇IR程度;2、丹瓜方含藥血清能增加IR-HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖消耗量及糖原含量,提高細(xì)胞胰島素敏感性,改善糖代謝紊亂,減輕IR;3、丹瓜方含藥血清能降低IR-HepG2細(xì)胞內(nèi)TC、TG含量,減輕細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積,改善脂代謝紊亂,修復(fù)細(xì)胞形態(tài)損傷;4、丹瓜方含藥血清改善糖脂代謝紊亂、減輕IR機(jī)制可能與調(diào)節(jié)胰島素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)因子(InsR、IRS-1、SH2B2、IGF-1、PTPN1及瘦素蛋白)的表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2649423