【摘要】：目的:糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病(diabetic mellitus,DM)最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,同時(shí)也是導(dǎo)致終末期腎病的第二大病因。該病的發(fā)病機(jī)制尚不明確,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腎小球?yàn)V過屏障中足細(xì)胞的損傷是導(dǎo)致蛋白尿產(chǎn)生的重要因素之一,其上的P-鈣粘素(P-cadherin)和瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道-6(transient receptor potential canonical-6,TRPC6)是近期發(fā)現(xiàn)的與蛋白尿產(chǎn)生密切相關(guān)的蛋白。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察化瘀通絡(luò)中藥不同配伍對(duì)DKD大鼠腎臟干預(yù)作用和對(duì)腎組織P-cadherin和TRPC6表達(dá)的影響,進(jìn)一步探索其可能的作用靶點(diǎn)。方法:將70只雄性SD大鼠,體重約為100±10g,隨機(jī)分為正常組(C組,n=8)和造模組(n=62),采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素(streptozotion,STZ)腹腔注射法(35 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型,72h后三次尾靜脈取血測(cè)隨機(jī)血糖(random blood glucose,RBG),均≥16.7mmol/L者即為模型制備成功,不符合標(biāo)準(zhǔn)者予以剔除。之后將成模的55只大鼠再隨機(jī)分為模型組(M組)、化瘀通絡(luò)中藥組(Q組)、厄貝沙坦組(I組)、化瘀組(H組)和通絡(luò)組(T組),每組11只,灌胃干預(yù)16周。分別于藥物干預(yù)后的第3天、4周末、8周末、12周末、16周末,收集各組大鼠24小時(shí)尿液,測(cè)定24小時(shí)尿量和24小時(shí)尿蛋白定量(24h urinary total protein,24h UTP);測(cè)量RBG、飲水量、攝食量,觀察其動(dòng)態(tài)變化。在16周末,水合氯醛麻醉大鼠后開腹剝離雙側(cè)腎臟,稱量腎重(kidney weight,KW),計(jì)算腎臟肥大指數(shù)(hypertrophy index,HI);腹主動(dòng)脈取血待行血液生化指標(biāo)檢測(cè);留取腎組織,待行光鏡、電鏡觀察,運(yùn)用免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry technique,IHC)、實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)和蛋白印跡法(Western Blot)進(jìn)行m RNA和蛋白表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果:1各組大鼠的一般情況C組大鼠精神狀態(tài)良好,活動(dòng)靈活,攝食飲水尿量無(wú)異常,體重平穩(wěn)增加。M組則精神逐漸萎靡,多飲多食多尿,體重較前減少。各治療組較M組,上述癥狀不同程度緩解。2不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠24小時(shí)攝食量、飲水量、尿量動(dòng)態(tài)變化與同一時(shí)間點(diǎn)C組相比,各造模組24小時(shí)攝食量、飲水量和尿量顯著增加(P0.05或P0.01);與同一時(shí)間點(diǎn)M組比較,各治療組攝食量在任何時(shí)間點(diǎn)均無(wú)差異(P0.05);飲水量和尿量在第16周出現(xiàn)差異,與同時(shí)間點(diǎn)M組比較,Q組和T組24小時(shí)飲水量和尿量均減少(P0.05或P0.01),I組和H組無(wú)明顯變化(P0.05)。3各組大鼠腎重、體重及腎臟肥大指數(shù)比較各組大鼠腎重間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與C組相比,各造模組體重顯著降低,腎臟肥大指數(shù)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與M組比較,Q組體重升高,腎臟肥大指數(shù)降低(P0.01),則I組、H組和T組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4各組大鼠24h UTP比較第3天,各組大鼠24h UTP組間無(wú)差異(P0.05)。第4周末,與C組比較,各造模組大鼠24h UTP均上升(P0.05),而各治療組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第8周末,與C組比較,各造模組大鼠24h UTP均上升(P0.01);與M組比較,Q組和I組大鼠24h UTP下降(P0.01),H組和T組無(wú)差異(P0.05)。第12周末,與C組比較,各造模組大鼠24h UTP均上升(P0.01);與M組比較,各治療組大鼠24h UTP均下降(P0.05或P0.01)。第16周末,與C組比較,各造模組大鼠24h UTP均上升(P0.01);與M組比較,各治療組大鼠24h UTP均下降(P0.05或P0.01);與I組比較,Q組下降(P0.05);與Q組比較,H組和T組稍高(P0.05)。5各組大鼠隨機(jī)血糖、血脂比較不同時(shí)間點(diǎn)C組大鼠RBG基本穩(wěn)定;各造模組RBG均顯著升高(P0.01),且各造模組組間無(wú)差異(P0.05)。與C組比較,各造模組大鼠膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇均升高(P0.05或P0.01)。與M組比較,各治療組大鼠甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇均降低(P0.05或P0.01);高密度脂蛋白膽固醇方面,Q組和T組大鼠升高(P0.01),I組和H組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6各組大鼠血清蛋白和腎功能比較各組間總蛋白(total protein,TP)和白蛋白(albumin,ALB)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與C組比較,M組大鼠血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,Scr)和尿酸(uric acid,UA)均升高(P0.01);與M組比較,Q組、I組和T組大鼠BUN均降低(P0.05或P0.01),H組大鼠無(wú)差異(P0.05),各治療組大鼠Scr和UA均降低(P0.05或P0.01)。7腎臟形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果7.1光鏡觀察結(jié)果光鏡下觀察C組腎小球結(jié)構(gòu)清晰。M組腎小球肥大,囊腔變窄,呈裂隙狀,系膜基質(zhì)增生堆積伴基底膜彌漫性增厚,腎小管排列紊亂。與M組比較,各治療組不同程度改善。7.2透射電鏡觀察結(jié)果透射電鏡下觀察C組腎小球結(jié)構(gòu)相對(duì)正常。M組結(jié)構(gòu)紊亂,基底膜彌漫性增厚,足突出現(xiàn)變寬、扁平、甚至融合消失。與M組比較,各治療組病理改變稍減輕。8免疫組化檢測(cè)腎皮質(zhì)P-cadherin、TRPC6的表達(dá)光鏡下可觀察到C組P-cadherin沿腎小球基底膜成線性分布,蛋白表達(dá)量較多;與C組比較,M組表達(dá)量明顯較少;與M組比較,Q組、I組表達(dá)明顯增加,H組和T組無(wú)明顯差異。C組TRPC6表達(dá)微弱;與C組比較,M組TRPC6表達(dá)較強(qiáng);與M組比較,各治療組不同程度改善;各治療組組間無(wú)明顯差異。9 Real-time PCR檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)P-cadherin和TRPC6 m RNA的表達(dá)與C組比較,M組P-cadherin m RNA水平顯著下調(diào)(P0.01);與M組比較,Q組和I組P-cadherin m RNA水平明顯上調(diào)(P0.01),H組和T組則無(wú)明顯上調(diào)(P0.05);與Q組和I組比較,H組和T組相對(duì)降低(P0.05或P0.01)。與C組比較,M組大鼠TRPC6 m RNA表達(dá)水平升高(P0.05);與M組比較,各治療組大鼠TRPC6 m RNA表達(dá)相對(duì)降低(P0.05);且各治療組組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。10 Western Blot檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)P-cadherin和TRPC6蛋白表達(dá)與C組比較,M組P-cadherin蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(P0.01);與M組比較,Q組和I組表達(dá)顯著上調(diào)(P0.01或P0.05),且該兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),H組和T組無(wú)明顯上調(diào)(P0.05);與Q組和I組比較,H組和T組相對(duì)降低(P0.05或P0.01)。與C組比較,M組TRPC6蛋白表達(dá)量顯著升高(P0.01);與M組比較,各治療組TRPC6表達(dá)顯著降低(P0.05);且各治療組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1高糖高脂飼料聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素腹腔注射法制備的DKD大鼠模型基本成功,先后出現(xiàn)多飲、多食、多尿,逐漸出現(xiàn)蛋白尿,且符合相應(yīng)的病理表現(xiàn)。2化瘀通絡(luò)中藥能夠改善DKD大鼠一般情況和血脂紊亂狀態(tài)、降低尿蛋白、保護(hù)腎功能、減輕病理?yè)p傷,起到腎保護(hù)作用。3化瘀通絡(luò)中藥可能通過上調(diào)P-cadherin和下調(diào)TRPC6蛋白表達(dá),維持足細(xì)胞穩(wěn)定性,減少尿蛋白,從而延緩DKD進(jìn)展。4化瘀中藥和通絡(luò)中藥同用,降低尿蛋白效果更佳,提示化瘀中藥與通絡(luò)中藥合用配伍更合理,可能存在協(xié)同作用。通絡(luò)中藥下調(diào)血尿素氮和保護(hù)腎功能等方面效果優(yōu)于化瘀中藥。
【圖文】：

圖 1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)攝食量ig.1 Food intake of rats in each group at different time poi0 4 8 12 16050100150200250300350400CMQIHTTime(week)lm/24h

0 4 8 12 1601020304050CMQIHTTime(week)g/24h圖 1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)攝食量Fig.1 Food intake of rats in each group at different time poin400
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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