【摘要】：研究目的:胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,其惡性程度較高,是最致命的惡性腫瘤之一。由于胰腺癌早期診斷困難,手術(shù)切除率低,加之晚期胰腺癌對非手術(shù)的治療手段反應(yīng)較差,導(dǎo)致胰腺癌5年生存率不足1%。胰腺癌細胞主要通過對細胞內(nèi)葡萄糖進行酵解而提供能量,在此過程中胰島素和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)發(fā)揮了重要作用。胰島素和IGF-1不但與自己的受體,即IR和IGF1R,特異地相結(jié)合,還可以與彼此的受體交叉結(jié)合,從而促進胰腺癌細胞的生長。干擾胰島素及其受體下游信號通路有可能對胰腺癌的發(fā)生發(fā)展起到調(diào)控作用。由于腫瘤細胞生長迅速,故瘤內(nèi)常常處于相對缺氧狀態(tài),所以胰腺癌細胞可表達缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)并形成HIF-1。當(dāng)腫瘤細胞高表達HIF-1α?xí)r,還可以激活下游的小窩蛋白(cav-1),使細胞的生長、糖酵解以及腫瘤的血管生成都會增加,這些因素都可以支持腫瘤細胞的快速生長。故HIF-1也是調(diào)節(jié)胰腺癌發(fā)生發(fā)展的一個重要靶點。此外,胰腺癌細胞即使在氧氣充足的情況下依然會出現(xiàn)激活糖酵解關(guān)鍵酶(如:HK-Ⅱ和PFK-1)使糖酵解活性增強的現(xiàn)象,即“瓦博格效應(yīng)”。瓦博格效應(yīng)除了可以給腫瘤細胞供能,還能夠促進肝臟糖異生(糖異生關(guān)鍵酶PCB和G-6-Pase活性增加)、刺激骨骼肌蛋白水解(代表肌肉降解的標(biāo)志物Atrogin-1和Mu RF-1高表達)以及促進脂肪組織的脂解(脂解關(guān)鍵酶ATGL活性增強),最終因體重減輕、機體負氮平衡而導(dǎo)致癌惡病質(zhì)的發(fā)生。抑制腫瘤細胞的瓦博格效應(yīng)是治療胰腺癌惡病質(zhì)的潛在靶點。五沒食子�；咸烟�(PGG)是一種存在于植物中的天然多酚化合物,PGG也是IR的配體,能夠與IR/IGF1R結(jié)合,對細胞中葡萄糖的代謝起到重要的調(diào)節(jié)作用。PGG被證明在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和肝癌等諸多惡性腫瘤的治療中均可發(fā)揮一定的抑制作用,其機制包括調(diào)節(jié)腫瘤細胞的細胞周期、調(diào)節(jié)HIF-1α的表達、調(diào)整細胞整體的營養(yǎng)代謝等途徑。本研究的目的是探究β-PGG能否在胰腺癌細胞中通過抑制IR/IGF1R活性和HIF-1α的表達水平從而抑制該細胞的瓦博格效應(yīng)并緩解胰腺癌荷瘤鼠的惡病質(zhì)狀態(tài)。研究方法:第一部分:1)應(yīng)用胰腺癌細胞系MiaPaCa-2作為研究對象,使用不同濃度胰島素(100 p M-1mM)刺激該細胞,在常氧和缺氧(1%氧)兩種條件下進行實驗。使用Western blot等方法檢測常氧、缺氧條件下胰腺癌細胞IR和IGF1R的磷酸化程度、下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2信號通路的激活情況、HIF-1α和cav-1的變化情況及細胞糖酵解通路的關(guān)鍵酶HK-Ⅱ和PFK-1等指標(biāo),觀察胰島素對胰腺癌細胞的刺激作用。2)使用β-PGG(5、13、25、50mM)作用于MiaPaCa-2和PANC-1細胞,使用Western blot方法在常氧和缺氧兩種條件下檢測細胞中IR、IGF1R、Akt和ERK的磷酸化水平、HIF-1α和cav-1表達水平及細胞糖酵解通路的活性(HK-Ⅱ和PFK-1)等指標(biāo),觀察β-PGG對上述信號通路的作用機制。3)使用β-PGG(25和50mM)作用于MiaPaCa-2細胞,隨后使用MTT實驗和集落形成實驗檢測了細胞短期和長期的增殖能力,使用遷移實驗和劃痕實驗檢測了細胞的遷移能力,觀察β-PGG對胰腺癌細胞表型的影響。第二部分:用MiaPaCa-2細胞建立胰腺癌荷瘤鼠動物模型,40只裸鼠隨機分為四組,每組10只,分別為對照組(intact athymic mice,I組),荷瘤組(untreated tumor carriers,U組)、PGG荷瘤給藥組(treated withβ-PGG,P組)、大黃酸荷瘤給藥組(treated with rhein,R組,作為陽性對照藥物組)。除對照組外,其余三組的實驗動物均在麻醉后采用二次成瘤的方法,在一側(cè)腋窩皮下植入由MiaPaCa2細胞生成的腫瘤組織塊(2 mm3),飼養(yǎng)1周后移植瘤生長良好,荷瘤鼠已經(jīng)有明顯的成瘤后開始給藥治療。P組攜瘤鼠經(jīng)灌胃給予β-PGG 20 mg/kg每日一次,R組給予大黃酸100 mg/kg每日一次,U組給予等體積的PBS每日一次,I組不處理。每周測量腫瘤的大小和記錄體重。給藥8周后,經(jīng)麻醉將動物處死取材。利用腫瘤形態(tài)測量、組織學(xué)染色、血漿生化指標(biāo)檢測、骨骼肌、脂肪、肝臟代謝狀態(tài)分析等研究方法,研究β-PGG的抗腫瘤能力及其對胰腺癌荷瘤鼠能量平衡的影響,分析腫瘤組織中IR和IGF1R的磷酸化程度、下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2信號通路的激活情況、HIF-1α和cav-1的變化情況及細胞糖酵解通路的活性(HK-Ⅱ和PFK-1)等。同時還將觀察β-PGG對肝臟中PCB和G-6-Pase的水平的影響、對骨骼肌中Atrogin-1和Mu RF-1的水平的影響、對脂肪中ATGL的水平的影響來評價荷瘤鼠惡病質(zhì)嚴重程度的改善情況。研究結(jié)果:體外實驗研究結(jié)果:1)胰島素作用于MiaPaCa-2細胞時,可以升高IR/IGF1R的磷酸化程度、激活下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2兩條信號通路、上調(diào)HIF-1α和cav-1的表達、增強細胞糖酵解關(guān)鍵酶HK-Ⅱ和PFK-1的活性。2)β-PGG能夠降低MiaPaCa-2細胞和PANC-1細胞中IR/IGF1R的磷酸化程度、抑制下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2兩條信號通路的激活、抑制HIF-1α和cav-1的表達、降低細胞糖酵解關(guān)鍵酶HK-Ⅱ和PFK-1的活性。在細胞表型方面能夠明顯抑制MiaPaCa-2細胞的增殖和遷移能力。體內(nèi)實驗研究結(jié)果:3)β-PGG能夠顯著抑制胰腺癌荷瘤鼠體內(nèi)腫瘤組織中IR/IGF1R的磷酸化程度、抑制下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2兩條信號通路的激活、抑制HIF-1α和cav-1的表達、降低細胞糖酵解關(guān)鍵酶HK-Ⅱ和PFK-1的活性。還能明顯縮小腫瘤的重量、體積和橫截面積,促進腫瘤細胞的凋亡,明顯抑制胰腺癌荷瘤鼠中瘤體的生長。4)β-PGG還能夠降低胰腺癌荷瘤鼠肝臟中PCB和G-6-Pase的水平、減低骨骼肌中Atrogin-1和Mu RF-1的水平、抑制脂肪中ATGL的活性。研究結(jié)論:胰腺癌發(fā)生時,胰島素可以通過激活受體的磷酸化、激活下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2兩條信號通路、上調(diào)HIF-1α和cav-1的表達等途徑增強細胞糖酵解的活性和瓦博格效應(yīng),在一定程度上促進了胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展。β-PGG能夠顯著抑制胰腺癌細胞內(nèi)胰島素受體及其下游信號通路的活性,明顯抑制HIF-1α通路的激活和顯著抑制癌細胞的瓦博格效應(yīng),抑制惡病質(zhì)動物體內(nèi)的肝糖異生、肌肉分解和脂肪水解程度。從而抑制胰腺癌腫瘤的生長,對腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)起到緩解作用,在一定程度上延緩了胰腺癌的病理進程。
【圖文】：

胞培養(yǎng)皿放置在顯微鏡下觀察細胞的消化程消失、變圓，間隔逐漸變大，折光性增加，有已消化完成，此時迅速倒掉胰蛋白酶消化液血清的完全培養(yǎng)基。移液器吹打細胞表面數(shù)次（注意細胞平面各個從培養(yǎng)皿上完全脫落。按照實驗要求留取一定其轉(zhuǎn)移入新的細胞培養(yǎng)容器內(nèi)，并保證細胞懸后放入 37°C 5 %CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)和進：細胞按常規(guī)操作完成消化后，將消化好的含新的 EP 管中使用無菌 PBS 對細胞進行稀釋（的細胞懸液，注入擦干凈的蓋有蓋玻片的血細細胞計數(shù)板共進行兩次計數(shù)（一共 8 個區(qū)域，上壓線，右、下壓線不算，見圖 1.1）總數(shù)÷8×10（稀釋倍數(shù)）×104= n 個/ml./ml×細胞原液總體積（5 ml）= 原培養(yǎng)瓶中的

素濃度在1-100nM之間時，胰島素刺激MiaPaCa-2細胞中HIF-1α表達具有劑量依賴性，并且缺氧條件下MiaPaCa-2細胞中HIF-1α表達量均高于在相同濃度胰島素作用下常氧條件下HIF-1α表達量（P均＜0.05，見圖1.2）。實驗結(jié)果表明：胰島素確實能夠刺激胰腺癌細胞中HIF-1α的表達。圖1.2 胰島素作用下MiaPaCa-2細胞中HIF-1α蛋白的表達情況（n=7，缺氧條件為1% 的氧濃度孵育6 h；圖中胰島素濃度：C,1, 2, 3, 4, 5分別代表0，0.1, 1, 10, 100,1000 nM，后圖同；與不加胰島素的對照組比較，*代表P＜0.05；與相同濃度胰島素作用時常氧條件組相比較，#P＜0.05，##P＜0.01）。由于小窩蛋白-1（cav-1）是受HIF-1α調(diào)控的下游蛋白，所以我們又檢測了使用不同濃度胰島素刺激下，MiaPaCa-2細胞在常氧和缺氧兩種條件下cav-1蛋白的表達水平。Western blot結(jié)果顯示：在常氧條件下MiaPaCa-2細胞中cav-1表達量較低
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2648187