【摘要】：目的:探討杜鵑花總黃酮(TFR)改善缺血性腦損傷的保護(hù)作用與腦基底動(dòng)脈瞬時(shí)受體電位通道4(TRPV4)、中電導(dǎo)的鈣激活鉀通道(IKca)、小電導(dǎo)的鈣激活鉀通道(SKca)的關(guān)系及可能存在的相關(guān)機(jī)制。方法:雄性SD(Sprague Dawley Rat)大鼠72只,8周齡,體質(zhì)量(240±20)g,自由飲食與飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,通過(guò)四血管阻斷法(four-vessel occlusion,4-VO)構(gòu)建全腦缺血再灌注(CIR)模型。將CIR大鼠隨機(jī)分為CIR組(NS,n=8)、TFR組(100 mg/kg,n=8)、TFR+TRPV4阻斷劑HC-067047組(100 mg/kg+10 mg/kg,n=8)、HC-067047組(10 mg/kg,n=8)、TFR+IKca阻斷劑TRAM-34組(100mg/kg+0.5 mg/kg,n=8)、TRAM-34組(0.5 mg/kg,n=8)、TFR+SKca阻斷劑Apamin組(100 mg/kg+0.3 mg/kg,n=8)、Apamin組(0.3 mg/kg,n=8),以SD大鼠為假手術(shù)組(NS,n=8)。于夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈前30 min尾靜脈注射上述藥物,造模完成24 h后處死大鼠。腦電波記錄儀檢測(cè)腦組織缺血前,缺血25 min及再灌注2 h大鼠腦電波;造模前稱(chēng)量大鼠體重,造模完成后取腦組織稱(chēng)量其濕重,比較各組大鼠大腦重量指數(shù)差異;大鼠腹主動(dòng)脈取血,分離血清,采用ELISA法檢測(cè)血清中MDA含量與LDH活性;HE及尼氏染色分別觀察大腦皮層病理學(xué)改變;采用動(dòng)脈加壓灌注法,觀察TFR對(duì)CIR大鼠CBA產(chǎn)生舒張作用的影響及TRPV4、IKca、SKca通道阻斷劑對(duì)其產(chǎn)生的影響;Western blot法檢測(cè)TFR對(duì)CIR大鼠腦基底動(dòng)脈TRPV4、IKca、SKca通道蛋白表達(dá)的影響及各阻斷劑對(duì)TRPV4、IKca、SKca通道蛋白表達(dá)的影響;RT-qPCR法檢測(cè)TFR對(duì)CIR大鼠CBA中TRPV4、IKca、SKca mRNA表達(dá)的影響及各阻斷劑對(duì)TRPV4、IKca、SKca通道m(xù)RNA表達(dá)的影響;激光共聚焦檢測(cè)TFR對(duì)CIR大鼠CBA平滑肌細(xì)胞Ca~(2+)濃度的影響以及TRPV4、IKca、SKca通道阻斷劑對(duì)其產(chǎn)生的影響。結(jié)果:(1)與Sham組相比,CIR組大鼠缺血前腦電波無(wú)明顯變化;當(dāng)缺血25min時(shí),腦電波逐漸變平,波動(dòng)變緩,波幅變低;再灌注2 h后腦電波逐漸恢復(fù)。(2)與Sham組相比,CIR組大鼠大腦重量指數(shù)明顯升高(P0.01);與CIR組相比,TFR組及TFR聯(lián)用各通道阻斷劑組大腦重量指數(shù)均呈不同程度降低(P0.01);與TFR組相比,TFR聯(lián)用HC-067047組大腦重量指數(shù)明顯升高(P0.05),TFR聯(lián)用TRAM-34組、Apamin組略有升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)ELISA法結(jié)果顯示,CIR組與Sham組相比,大鼠血清中MDA含量及LDH活性顯著升高(P0.01);與CIR組相比,TFR組及TFR聯(lián)用各通道阻斷劑組MDA含量及LDH活性顯著降低(P0.05,P0.01);與TFR組相比,TFR聯(lián)用各阻斷劑組MDA含量及LDH活性均有所升高(P0.05,P0.01)。(4)HE及尼氏染色顯示CIR大鼠腦組織大量細(xì)胞萎縮變性、胞核深染、胞質(zhì)空泡、神經(jīng)纖維崩解,TFR組及TFR聯(lián)用各阻斷劑組腦組織病理變化呈不同程度改善。(5)動(dòng)脈加壓灌注結(jié)果顯示,累加濃度的TFR能劑量依賴(lài)性的舒張CIR大鼠CBA,而使用TRPV4、IKca、SKca通道阻斷劑預(yù)處理后出現(xiàn)不同程度抑制血管舒張反應(yīng)的現(xiàn)象。(6)Western blot法結(jié)果表明,CIR組較Sham組,大鼠CBA中TRPV4、IKca、SKca蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.01);與CIR組相比,TFR組CBA中TRPV4、IKca、SKca蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.01),聯(lián)用各通道阻斷劑組CBA中TRPV4、IKca、SKca蛋白表達(dá)均有所升高(P0.05),單用各通道阻斷劑組CBA中TRPV4、IKca、SKca蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05,P0.01);與TFR組相比,各聯(lián)用通道阻斷劑組CBA中TRPV4、IKca、SKca蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05,P0.01)。(7)RT-qPCR結(jié)果顯示,CIR組較Sham組,大鼠CBA中TRPV4、IKca、SKca mRNA表達(dá)顯著降低(P0.01);與CIR組相比,TFR組CBA中TRPV4、IKca、SKca mRNA表達(dá)顯著升高(P0.01),聯(lián)用各通道阻斷劑組CBA中TRPV4、IKca、SKca mRNA表達(dá)均有所升高(P0.01),單用各通道阻斷劑組CBA中TRPV4、IKca、SKca mRNA表達(dá)明顯下降(P0.05,P0.01);與TFR組相比,聯(lián)用各通道阻斷劑組CBA中TRPV4、IKca、SKca mRNA表達(dá)明顯下降(P0.05,P0.01)。(8)激光共聚焦結(jié)果顯示,與Sham組相比,CIR組大鼠CBA平滑肌細(xì)胞Ca~(2+)熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P0.01);與CIR組相比,TFR組及TFR聯(lián)用各阻斷劑組Ca~(2+)熒光強(qiáng)度呈不同程度減弱(P0.05,P0.01);與TFR組比較,TFR聯(lián)用各阻斷劑組Ca~(2+)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P0.01)。結(jié)論:TFR對(duì)全腦缺血再灌注大鼠腦損傷具有明顯的改善作用,其機(jī)制可能與TFR作用于腦基底動(dòng)脈,激活TRPV4通道,繼而激活I(lǐng)Kca與SKca通道,使內(nèi)源性EDHF增多,導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)皮依賴(lài)性超極化,阻滯Ca~(2+)內(nèi)流,促使腦基底動(dòng)脈舒張有關(guān)。
【圖文】：

圖 4 TRPV4 等各阻斷劑對(duì) TFR 改善 CIR 大鼠大腦皮層病理學(xué)改變的影響（尼氏染色，×400 倍）Fig 4 Effects of various blockers such as TRPV4 on the pathological changes of cerebracortex in CIR rat induced by TFR (Nissl staining, × 400)A:Sham；B:CIR；C:TFR；D:TFR+HC-067047；E:TFR+Apamin；F: TFR+TRAM-. HE 染色觀察大鼠腦組織病理學(xué)改變?nèi)鐖D 5 所示，與 Sham 組相比，CIR 組大鼠腦組織細(xì)胞出現(xiàn)大量空泡，萎圍間隙增大，神經(jīng)纖維崩解以及小血管增生，并見(jiàn)有少量膠質(zhì)細(xì)胞水腫。IR 組相比，TFR 組腦組織病變明顯改善，但仍存在少量細(xì)胞變性；各聯(lián)用阻組的腦組織細(xì)胞變性壞死仍較明顯，但較 CIR 組有所改善。提示 TFR 對(duì)全血再灌注大鼠腦組織具有保護(hù)作用，且可能與 TRPV4、SKca 及 IKca 通道

圖 5 TRPV4 等各阻斷劑對(duì) TFR 改善 CIR 大鼠腦組織病理學(xué)改變的影響（HE 染色，×400 倍）Fig 5 Effects of various blockers such as TRPV4 on the pathological changes of cerebratissue in CIR rat induced by TFR (HE staining, × 400)：Sham；B：CIR；C：TFR；D：TFR+HC-067047；E：TFR+Apamin；F：TFR+TRAM. 動(dòng)脈加壓灌注法檢測(cè) CIR 大鼠 CBA 舒張作用的改變.1 TFR 對(duì) CIR 大鼠 CBA 舒張作用的影響如表 5、圖 6、圖 7 所示，，在 PSS 液中加入 L-NAME(3×10-5mol/L)和 I10-5mol/L）預(yù)灌注 CIR 大鼠 CBA 30 min 后，加入 30 mmol/L KCl 使血管收定，再依次灌注含有 TFR（11~2700 mg/L）的 PSS 液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 NO 和 PGI2血管舒張作用的情況下，累加濃度的 TFR 仍能使 CBA 產(chǎn)生濃
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2648197