【摘要】：目的:大氣污染細顆粒物暴露與心血管疾病的發(fā)病率和死亡率存在著明確的因果關(guān)系,被視為心血管疾病可改變危險因素。我國境內(nèi)長期大氣污染細顆粒物高濃度暴露使公民身體健康存在極大風險。在前期研究基礎上,通過建立體內(nèi)和體外大鼠心肌缺血損傷模型,觀察生脈散(SM)對細顆粒物(Standard Reference Material 1650b:Diesel Particulate Matter,DPM)致心肌缺血性損傷的保護作用,探討SM對該損傷的保護作用及初步機制。方法:1.建立DPM染毒致體內(nèi)心肌缺血損傷模型,造模前給予SM一周,一次性氣管滴注DPM混懸液(急性暴露),24 h后行大鼠冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù),術(shù)后觀察SM對大鼠心臟的保護作用并初步探討機制。2.通過Langendorff灌流系統(tǒng)建立離體心臟缺血再灌注模型,給予SM和DPM混懸液,后進行全心缺血再灌注,觀察DPM對大鼠心臟的直接損傷和SM的保護作用。3.建立DPM損傷心肌細胞H9c2模型,觀察SM對該損傷的線粒體功能及Nrf2通路的影響。體內(nèi)實驗:SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、SM低劑量組、SM中劑量組、SM高劑量組。SM灌胃給藥一周,假手術(shù)組和模型組灌胃給予等體積0.9%生理鹽水;后行氣管滴注DPM混懸液100μg/kg進行染毒,24 h后將大鼠麻醉行冠狀動脈左前降支結(jié)扎手術(shù),結(jié)扎24 h后,腹主動脈取血,使用生化試劑盒檢測血清中LDH、CK-MB含量;檢測抗氧化指標SOD、MDA、CAT、GSH-Px、NOX含量;采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)檢測血清中cTnT含量;心肌組織切片后采用TTC染色法評價心臟梗死面積,HE染色觀察病理學變化,透射電鏡觀察心肌組織及線粒體超微結(jié)構(gòu);采用qPCR芯片檢測線粒體氧化應激差異蛋白,qPCR檢測Nrf2及下游基因的表達。離體實驗:SD大鼠稱重后隨機分為正常對照組、維拉帕米陽性藥組、模型組、SM 0.14mg/mL組、SM 0.28 mg/mL組。SD麻醉后開胸剪下完整心臟,將心臟懸掛于Langendorff主動脈套管上,并逆行灌注。對K-H液37℃、95%O_2-5%CO_2混合氣持續(xù)氧合。將自制球囊插入左心室,壓力傳感器連接多導生理記錄儀,全程記錄灌注壓(PP)、心電圖及心室壓力曲線。平衡后給藥灌流10 min,灌注10μg/mL DPM混懸液30 mL,全心缺血40 min再灌注40 min,檢測HR、LVEDP、LVSP并計算LVDP、±dp/dt_(max)、RPP;留取再灌注末期心臟冠脈流出液檢測cTnT含量。細胞實驗:采用DPM 100μg/mL作用24 h染毒H9c2心肌細胞作為細胞損傷模型,采用CCK8檢測SM對DPM所致?lián)p傷的作用。采用DCFH-DA探針檢測細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量,JC-1探針檢測線粒體膜電位,XFe能量代謝儀器定量檢測線粒體呼吸,評價SM對DPM染毒的線粒體功能的影響。結(jié)果:1.體內(nèi)實驗:(1)與假手術(shù)組相比,DPM致大鼠心肌面積梗死面積顯著增大(P0.001),LDH、CK-MB、cTnT含量顯著增高;心肌組織病理學見血管與心肌纖維間隙增大,炎性細胞浸潤,局部心肌纖維水腫;心肌超微結(jié)構(gòu)有部分心肌細胞水腫,肌小節(jié)明暗帶模糊不清,線粒體出現(xiàn)腫脹和嵴溶解。與模型組相比,SM組梗死面積顯著減小(P0.001);LDH、CK-MB、cTnT含量顯著降低;組織病理學炎性細胞浸潤減少,心肌纖維間間隙減小,肌原纖維排列整齊,肌小節(jié)結(jié)構(gòu)清晰;線粒體結(jié)構(gòu)偶見腫脹,嵴結(jié)構(gòu)致密規(guī)則;(2)與假手術(shù)組相比,模型組CAT、GSH-Px含量顯著降低(P0.05),MDA、NOX含量顯著升高(P0.01);與模型組相比,SM低劑量組CAT含量顯著增高(P0.05),中劑量組GSH-Px含量顯著增高(P0.05);SM各劑量組MDA、NOX含量顯著降低(P0.05);(3)與假手術(shù)組相比,DPM致Cat、Gstk1基因顯著下調(diào),Ucp3基因下調(diào),Cyba基因上調(diào);與模型組相比,SM作用后Cat、Gstk1、Ucp3基因顯著上調(diào),Cyba基因下調(diào);(4)與假手術(shù)組相比,DPM致Nrf2、HO-1、CAT、SOD1、GPX1、NQO1 mRNA相對表達水平明顯降低(P0.05),NOX mRNA明顯升高(P0.001),SM低劑量組CAT、GPX1相對表達水平明顯升高(P0.05),NOX明顯下降(P0.001),SM中劑量組CAT、SOD1、GPX1相對表達水平明顯升高(P0.05)。2.離體實驗:(1)與正常對照組比較,模型組DPM致離體大鼠心臟心電圖ST段抬高,心率異常,PP顯著升高(P0.01),LVDP、dp/dt_(max)、RPP顯著降低(P0.001);(2)與模型組比較,SM對離體心臟功能未見顯著保護作用,PP值下降,LVDP、dp/dt_(max)、RPP升高,無統(tǒng)計學差異;維拉帕米組PP顯著下降(P0.05),dp/dt_(max)、LVDP、RPP顯著升高(P0.001);(3)與正常對照組比較,模型組cTnT含量顯著升高(P0.05);與模型組比較,SM 0.28 mg/mL使cTnT含量顯著降低(P0.05)。3.細胞實驗:(1)CCK8檢測100μg/mL DPM對細胞作用后細胞的存活率為57%,SM作用后,細胞存活率均有增加,選擇SM 0.28 mg/mL、SM 0.56 mg/mL、SM 1.12 mg/mL完成后續(xù)實驗;(2)DPM染毒24 h后,細胞內(nèi)ROS水平增高(P0.05);預處理SM可顯著減少ROS的產(chǎn)生(P0.01);(3)DPM作用后,線粒體膜電位細胞內(nèi)綠色熒光增多,膜電位下降;SM預處理后,細胞綠色熒光減少,膜電位升高,無統(tǒng)計學差異;(4)DPM作用后,線粒體基礎呼吸值、ATP產(chǎn)生量、非線粒體呼吸消耗值增大,與正常組相比,有統(tǒng)計學差異(P0.05);SM預處理后,以上值均顯著下降(P0.05),保護線粒體呼吸功能;結(jié)論:本研究證實DPM對心肌缺血性損傷有加重作用,損傷心肌細胞及線粒體功能,DPM作為外界刺激引起機體氧化應激,使機體相關(guān)抗氧化因子與Nrf2通路下游II相解毒酶表達異常,機體防御能力下降;同時,氧化應激產(chǎn)生過量ROS,進而影響線粒體功能,對線粒體呼吸的影響又產(chǎn)生更多ROS損傷心肌細胞;SM可能通過Nrf2通路調(diào)動機體抗氧化防御,平衡機體氧化應激水平,從而保護心臟功能,對DPM造成的損傷有良好的保護作用。
【圖文】：

輕墊少許無菌棉球以保護左肺，然后用無菌棉球推開胸腺暴露出心耳和肺動脈圓錐。結(jié)扎位置：左心耳與肺動脈圓錐交界處下2-3 mm處，用4-0線穿過心肌冠狀動脈左前降支結(jié)扎，具體位置見圖1，在此束心肌表面放一根長約1cm、直徑2 mm的細棉線，輕輕拉緊絲線兩端，連同細棉線一同結(jié)扎冠狀動脈前降支。對出血部位采用無菌棉止血后，，逐層關(guān)胸，在關(guān)胸過程中，隨時用手擠壓胸腔以排空胸腔中的空氣，以防氣胸。關(guān)胸后斷開呼吸機，并幫助大鼠使其恢復自主呼吸，保溫至其自然蘇醒。圖1 冠狀動脈LAD結(jié)扎具體位置摘自 http://www.cmuh.cmu.edu.tw/web/showmedical.php?docid=893&id=11.2.4 取材方法心肌缺血結(jié)扎術(shù)后 24 h，大鼠麻醉后打開腹腔于腹主動脈取血 8 mL，3500rpm/min 離心 15 min，取血清-80℃凍存待測。將心肌組織切片進行 TTC 染色

山西醫(yī)科大學碩士學位論文果中各片心肌組織的梗死區(qū)域面積與全部心肌面積的正反面進行計顯示：假手術(shù)組心梗面積占比 10%，模型組為 50%，心梗面積明；SM 低劑量組心梗面積占比 26%，SM 中劑量組為 20%，SM 高顯著小于模型組（P < 0.001），其中 SM 高劑量組減小比例最大。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2647570