【摘要】：本課題受到國家自然基金NO.81673618資助,旨在通過CNT2探討菊苣提取物降尿酸作用機制。研究背景高尿酸血癥全球發(fā)病率逐年增加,在我國已達到10%,在沿海經(jīng)濟發(fā)達城市甚至達到25%。目前,我國經(jīng)濟的發(fā)展、飲食的變化等因素更是加劇了高尿酸血癥發(fā)病率的增長,并且高尿酸血癥與痛風、代謝性疾病、心血管疾病、高血壓、腎臟疾病、2型糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關,已成為繼高血糖、高血壓、高血脂后不容忽視的第四高。高尿酸血癥(Hyperuricaemia,HUA)是血尿酸水平在體內持續(xù)性升高或者血尿酸過飽和的一種病理狀態(tài)。尿酸是嘌呤代謝的終產(chǎn)物,血尿酸水平是基于嘌呤的吸收、嘌呤的代謝以及尿酸的排泄之間的平衡,嘌呤攝入增多、嘌呤代謝紊亂、尿酸排泄減少或三者共同作用均可導致高尿酸血癥的發(fā)生。臨床中常用的降尿酸藥物主要包括兩類,抑制嘌呤代謝酶活性的藥物,如非布司他、托匹司他、別嘌呤醇等;增加尿酸排泄的藥物,如苯溴馬隆、丙磺舒、新型URAT-1抑制劑、尿酸酶等,而目前臨床上尚無作用于嘌呤吸收途徑的降尿酸藥物。大量流行病學研究顯示富含嘌呤飲食的過量攝入是高尿酸血癥發(fā)病的危險因素,并且有實驗證明攝入酵母核酸僅在幾天內就能誘發(fā)健康受試者血尿酸水平升高。同時有實驗證明,低嘌呤飲食可使高尿酸血癥患者血清尿酸水平降低。因此可以看出嘌呤攝入增加確可增加血尿酸水平,抑制其腸胃吸收可以作為防治高尿酸血癥的一個作用環(huán)節(jié)。嘌呤(Purine)類物質胃腸道吸收的主要部位在小腸,吸收主要形式是核苷,核苷的跨膜運輸需要依賴核苷轉運蛋白。人體內核苷轉運蛋白主要有兩類:濃度型核苷轉運體(concentrative nucleoside transporter,CNTs 或 SLC28)和平衡型核苷轉運體(equilibrative nucleoside transporter,ENTs或SLC29)。CNTs是Na+依賴的富集型核苷轉運蛋白,是一種主動轉運蛋白,可逆濃度差將細胞外核苷轉運至細胞內,主要分布在腸上皮細胞頂膜;ENTs是通過易化擴散方式轉運嘧啶和嘌呤類物質,主要分布在腸上皮細胞基底外側膜,其中,濃度型核苷轉運體CNT2是腸道吸收轉運嘌呤核苷的主要轉運體。hCNT2是嘌呤核苷特異性轉運蛋白,在胃、空腸、回腸和腎等臟器豐富表達,在小腸上皮細胞吸收嘌呤核苷的過程中,CNT2起主要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)CNT2的蛋白和mRNA表達水平升高,使外源添加的核苷酸經(jīng)載體轉運量增加。亦有實驗證實口服給予猴CNT2選擇性抑制劑可通過抑制腸道嘌呤核苷的攝入顯著降低血尿酸水平。同時實驗室前期虛擬篩選出菊苣中含有的可與CNT2結合的咖啡酸類、黃酮類及倍半萜類等21個化合物,其中含量較高、專屬性相對較強的菊苣酸可抑制IEC-6細胞CNT2對腺苷的轉運。那么菊苣提取物能否通過干預CNT2的表達而影響腸道的嘌呤核苷吸收?嘌呤的過量吸收對內源性核苷酸合成途徑及嘌呤的分解代謝途徑的關鍵酶以及血清尿酸水平的影響又是如何?尚有待研究�；谶@些生活與臨床中的問題,提出如下假說:高尿酸血癥的發(fā)病原因之一是過量的嘌呤攝入使得腸道嘌呤轉運蛋白CNT2表達增多,而CNT2的表達增加又可引起腸道嘌呤吸收增加,嘌呤代謝酶活化,尿酸生成增多。健脾祛濕中藥菊苣可通過對腸道CNT2的調控發(fā)揮降尿酸的作用機制。為驗證此假說,本實驗利用大鼠和鵪鶉兩種高尿酸血癥模型動物進行實驗研究。研究目的第一:切入腸道嘌呤轉運蛋白CNT2,從腸道嘌呤吸收角度明確HUA大鼠和鵪鶉CNT2表達與高尿酸血癥發(fā)病的病理聯(lián)系,并結合嘌呤代謝途徑關鍵酶活性進一步闡釋兩種模型動物的病理表現(xiàn)。第二:通過分析菊苣提取物對高尿酸血癥大鼠及鵪鶉腸道CNT2、嘌呤代謝途徑關鍵酶的影響,以及菊苣提取物對HUA鵪鶉空腸外翻腸囊轉運腺苷的干預,探討其降尿酸可能的干預環(huán)節(jié)和作用機制。研究方法本論文包括文獻綜述研究和實驗研究兩部分。文獻綜述部分通過查閱國內外近十年文獻,對高尿酸血癥流行病學特征、發(fā)病機制、中醫(yī)藥治療的研究進展以及腸道嘌呤轉運蛋白的研究進展及其與高尿酸血癥的關聯(lián)進行梳理,為后續(xù)實驗研究提供理論與方法基礎。實驗研究部分采用病因誘導法復制動物模型,利用高嘌呤食餌一定劑量的酵母誘導的HUA鵪鶉模型,利用同大鼠模型相同劑量的酵母合用小劑量腺嘌呤誘導HUA大鼠模型。結合生化檢測、實時熒光PCR、Western Blotting、免疫組化、高效液相等實驗手段,從整體動物、器官、組織、分子多層面對嘌呤轉運蛋白CNT2病理狀態(tài)下的表達變化進行研究,闡釋菊苣提取物對于兩種模型動物血清尿酸水平、嘌呤代謝酶活性、嘌呤吸收量、CNT2蛋白、mRNA表達量等的干預作用。實驗研究內容分為兩個章節(jié)。第一章高尿酸血癥狀態(tài)下模型動物小腸CNT2的表達研究結合實驗室前期基礎及文獻檢索結果,選擇嘌呤攝入增多為誘因的高尿酸血癥大鼠模型,篩選造模劑劑量,復制高尿酸血癥大鼠模型,觀察高尿酸血癥大鼠血尿酸水平、大鼠腸道CNT2表達變化。復制高嘌呤食餌誘導的高尿酸血癥鵪鶉模型,檢測其小腸CNT2的表達變化,探討高尿酸血癥狀態(tài)下CNT2的表達變化,為后續(xù)藥理藥效研究奠定基礎。第二章探討菊苣提取物對高尿酸血癥大鼠、鵪鶉小腸CNT2表達的影響在病理研究的基礎上,明確菊苣提取物對高尿酸血癥大鼠、鵪鶉小腸CNT2mRNA及蛋白表達的干預,探討菊苣提取物對高尿酸血癥大鼠、鵪鶉嘌呤代謝關鍵酶的影響,以及菊苣提取物對HUA鵪鶉空腸外翻腸囊腺苷轉運的干預,闡釋菊苣提取物降尿酸可能的作用環(huán)節(jié)及機制。研究結果高尿酸血癥狀態(tài)下模型動物小腸CNT2的表達研究結果顯示:①一定劑量酵母聯(lián)合腺嘌呤誘導的高尿酸血癥大鼠模型、高嘌呤食餌誘導的高尿酸血癥鵪鶉模型的血清尿酸水平持續(xù)穩(wěn)定的升高,模型比較穩(wěn)定。②與正常組相比,高尿酸血癥大鼠十二指腸、空腸、回腸的CNT2 mRNA相對表達量均增加,其中空腸的CNT2 mRNA表達增加顯著。③與正常組相比,高尿酸血癥鵪鶉空腸CNT2蛋白相對表達量顯著增加。菊苣提取物對高尿酸血癥大鼠、鵪鶉的小腸CNT2表達的干預結果顯示:①菊苣提取物可穩(wěn)定降低模型動物的血清尿酸水平、血清及肝臟中嘌呤代謝酶活性。②菊苣提取物可顯著下調高尿酸血癥大鼠CNT2 mRNA、蛋白相對表達量,顯著下調高尿酸血癥鵪鶉CNT2蛋白相對表達量。③腸囊外翻實驗中菊苣提取物可降低高尿酸血癥鵪鶉空腸底物的轉運量。研究結論1.HUA大鼠、鵪鶉腸道嘌呤轉運蛋白CNT2相對表達量上調與血清尿酸水平升高存在病理聯(lián)系。2.中藥菊苣的成分可與CNT2結合,干預小腸CNT2的相對表達量,及腸道嘌呤的吸收轉運。菊苣提取物可顯著下調高尿酸血癥大鼠腸道嘌呤轉運蛋白CNT2mRNA及蛋白表達、高尿酸血癥鵪鶉腸道CNT2蛋白表達,減少模型動物腸道嘌呤吸收,降低嘌呤代謝酶活性,從而達到降尿酸的作用機制。創(chuàng)新點:1.從嘌呤吸收的角度切入,探討高尿酸血癥大鼠、鵪鶉兩種動物模型HUA與腸道嘌呤轉運蛋白CNT2的相對表達量的病理聯(lián)系。2.發(fā)現(xiàn)菊苣提取物降尿酸的作用機制之一是顯著下調模型動物腸道CNT2的相對表達量,減少嘌呤吸收。
【圖文】：

低（Ｐ＜０．０５），乙胺丁醇組、酵母＋腺嘌呤組大鼠體重在１４４２ｄ顯著降低（Ｐ＜０．０５），逡逑酵母＋乙胺丁醇組大鼠體重在２８￣４２ｄ顯著降低（Ｐ＜０．０５），酵母＋小劑量乙胺丁醇組大鼠逡逑體重在７ｄ、２８￣４２ｄ顯著降低（ＰＣ０．０５）。結果如表２，，圖１所示。逡逑表２各組大鼠不同時間體重變化（ｇ

４９ｄ攝食量顯著減少（Ｐ＜０．０５），乙胺丁醇組在２１ｄ攝食量顯著增加（Ｐ＜０．０５），酵母＋逡逑乙胺丁醇組及酵母＋小劑量乙胺丁醇組在４２ｄ、４９ｄ攝食量顯著減少（Ｐ＜０．０５）。如表３，逡逑圖２所示。逡逑表３各組大鼠不同時間攝食量變化（ｇ／ｋｇ，Ｔ±ｓ，ｎ＝１０）逡逑組別邐７ｄ邐１４ｄ邐２１ｄ邐２８ｄ邐３５ｄ邐４２ｄ逡逑正常組邐９６．３９±５．９０邐７５．９６士９．２５邐７４．２０±５．００邐６８．７１±６．６９邐５７．８７±６．００邐５９．０６±２．４１逡逑酵母組邐９１．１８±５．７９邐６９．１６±ｌ0．３５邐６９．５３±５．９５邐６３．３７±６．８６邐５０．０９±４．５６＊邐５０．３４±２．３７＊逡逑腺嘌呤組邐７９．５７±６．７１＊邐７５．０４±６．４７邐８１．６４土５．９５＊邐７２．８５±８．０８邐６０．４１士６．７３邐４６．６４±５．０８＊逡逑乙胺丁醇組邐９３．９７±６．０５邐７８．６８±１０．４１邐８４．８３±４．３６＊邐７７．５４±８．８８邐６１．７６±９．９１邐５７．４１±４．６７逡逑酵母＋腺嘌呤組邐８９．４７±９．０４邐６８．０８±１１．３７邐５９．８２±３．７６＊邐５０．７１±１０．１８＊邐４５．１４±８．６５＊邐４１．５１±５．４４＊逡逑酵母＋小劑量腺邐９５．９０±７．２８邐７３．４０±９．０９邐６６．３７±５．５５＊邐６２．０２±３．６９邐５１．６８±５．５２邐４９．５１±３．２２＊逡逑嘌呤組逡逑酵母＋乙胺丁醇邐９４．２５±４．３２邐７１．４２±１１．２０邐７４．３８±１．
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2647249