發(fā)布時(shí)間：2020-05-01 22:23

【摘要】：目 的:通過(guò)觀察胡椒堿對(duì)C57BL/6小鼠膽固醇結(jié)石形成的影響,檢測(cè)血清及膽汁中脂質(zhì)水平的表達(dá),以LRH-1調(diào)控肝臟膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)信號(hào)通路作為切入點(diǎn),揭示胡椒堿抑制膽囊膽固醇結(jié)石形成及部分生物學(xué)機(jī)制,為臨床預(yù)防膽囊膽固醇結(jié)石病藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料與方法:1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠90只,10-14周齡,體重為20±2g,分籠飼養(yǎng),適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后,隨機(jī)分為6組,即空白組、模型組、熊去氧膽酸組(90 mg·kg-1)、胡椒堿低劑量組(20 mg·kg-1)、胡椒堿中劑量組(40 mg·kg-1)和胡椒堿高劑量組(60 mg·kg-1),每組15只。2.造模及用藥干預(yù)造模同時(shí)用藥干預(yù)。除空白組喂食普通飼料外,其余各組均喂食高脂飼料(基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇+0.5%膽酸+15%牛油)。陽(yáng)性對(duì)照組藥物劑量根據(jù)小鼠與成人體重等效劑量換算�？瞻捉M和模型組每天上午10:00給予等量的0.5%CMC-Na溶液灌胃,熊去氧膽酸組每天上午10:00給予熊去氧膽酸溶液灌胃,胡椒堿各劑量組按劑量要求每天上午10:00給予等量的溶于0.5%CMC-Na的胡椒堿灌胃。飼養(yǎng)4周。3.取材 取材實(shí)驗(yàn)前,小鼠禁食禁水12 h,稱重,記錄。采用摘眼球取血的方法收集血液;打開腹腔,觀察膽固醇結(jié)石成石情況并計(jì)算結(jié)石發(fā)生率(簡(jiǎn)稱結(jié)石率);以游標(biāo)卡尺測(cè)量膽囊長(zhǎng)徑和寬徑,計(jì)算膽囊容積,并收集膽囊膽汁;切取全部肝臟組織凍存于-80℃冰箱備用。4.檢測(cè)指標(biāo)(1)小鼠一般狀態(tài)觀察:觀察各組小鼠皮毛、活動(dòng)能力、反應(yīng)能力等一般狀態(tài)。(2)計(jì)算各組小鼠膽囊結(jié)石成石率:膽囊結(jié)石成石率(%)=每組生成膽囊結(jié)石小鼠數(shù)/每組小鼠數(shù)× 1 00%;(3)計(jì)算各組小鼠膽囊容積:膽囊容積根據(jù)橢圓公式計(jì)算:容積(μL)=長(zhǎng)徑(mm)×寬徑(mm)×深徑(mm)×π/6(近似認(rèn)為膽囊寬徑等于深徑);(4)采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠膽汁中的TC、TBA、PL含量,根據(jù)三者含量,計(jì)算CSI;(5)采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量;(6)采用Western-blot技術(shù)檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中LRH-1、SRBI、ABCG5、ABCG8的蛋白含量;(7)采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中LRH-1、SRBI、ABCG5、ABCG8的mRNA含量表達(dá)。結(jié) 果:1.胡椒堿對(duì)C57BL/6小鼠膽囊膽固醇結(jié)石成石的影響 1.1各組小鼠一般狀態(tài)情況 各組小鼠活潑好動(dòng),毛色光亮,精神狀態(tài)及食欲均好。各組小鼠無(wú)死亡情況出現(xiàn)。1.2各組小鼠成石率的比較 各組小鼠成石率:空白組、模型組、熊去氧膽酸組,胡椒堿低、中、高組結(jié)石率分別為0%、100%、20%、80%、46.7%、13.3%。與模型組相比,胡椒堿低劑量組成石率未有明顯改變(P0.05),其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.胡椒堿對(duì)C57BL/6小鼠血清中脂質(zhì)水平的影響2.1各組小鼠膽囊容積的比較 與空白組相比,模型組、熊去氧膽酸組和胡椒堿低、中、高各組小鼠膽囊容積明顯增大(P0.05);與模型組相比,熊去氧膽酸組、胡椒堿中劑量組和胡椒堿高劑量組小鼠膽囊容積明顯減小(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低劑量組小鼠膽囊容積明顯增大(P0.05),胡椒堿高劑量組小鼠膽囊容積明顯減小(P0.05)。2.2各組小鼠膽囊膽汁中CSI的比較 與空白組相比,模型組、熊去氧膽酸組、胡椒堿低、中、高各組小鼠CSI值明顯升高(P0.05),且模型組與胡椒堿低劑量組的CSI1,提示為膽固醇過(guò)飽和膽汁;與模型組相比,熊去氧膽酸組與胡椒堿組的CSI值明顯降低(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低、中劑量組CSI值明顯升高(P0.05),胡椒堿高劑量組CSI值明顯降低(P0.05)。2.3各組小鼠血清中TC、TG含量的比較 與空白組相比,模型組、熊去氧膽酸組以及胡椒堿低、中、高各組小鼠TC含量明顯上升(P0.05);與模型組相比,熊去氧膽酸組、胡椒堿中、高劑量組TC含量明顯下降(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低、中劑量組TC含量明顯升高(P0.05)。與空白組比較,模型組TG含量明顯上升(P0.05);與模型組相比,熊去氧膽酸組、胡椒堿中、高劑量組TG含量明顯下降(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低劑量組TG含量明顯升高(P0.05)。2.4各組小鼠血清中LDL-C、HDL-C含量的比較 與空白組相比,模型組、熊去氧膽酸組以及胡椒堿低、中、高各組小鼠LDL-C含量明顯上升(P0.05);與模型組相比,熊去氧膽酸組、胡椒堿中、高劑量組LDL-C含量明顯下降(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低、中劑量組LDL-C含量明顯升高(P0.05)。與空白組相比,模型組和胡椒堿低劑量組HDL-C含量明顯下降(P0.05);與模型組相比,熊去氧膽酸組和胡椒堿中、高劑量組HDL-C含量明顯升高(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低劑量組HDL-C含量明顯下降(P0.05)。3.胡椒堿對(duì)膽固醇結(jié)石小鼠肝臟LRH-1/SRBI及LRH-1/ABCG5/ABCG8信號(hào)通路的影響3.1各組小鼠肝臟組織LRH-1的蛋白表達(dá)比較 與空白組相比,模型組、熊去氧膽酸組和胡椒堿低、中劑量組LRH-1的蛋白表達(dá)明顯上升(P0.05);與模型組相比,熊去氧膽酸組、胡椒堿中、高劑量組LRH-1的蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低、中劑量組LRH-1的蛋白表達(dá)明顯升高(P0.05),胡椒堿高劑量組LRH-1的蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05)。3.2各組小鼠肝臟組織SRBI的蛋白表達(dá)比較 與空白組相比,模型組、熊去氧膽酸組和胡椒堿低、中劑量組SRBI的蛋白表達(dá)明顯上升(P0.05);與模型組相比,熊去氧膽酸組、胡椒堿中、高劑量組SRBI的蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低劑量組SRBI的蛋白表達(dá)明顯升高(P0.05),胡椒堿高劑量組SRBI的蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05)。3.3各組小鼠肝臟組織ABCG5蛋白表達(dá)比較 與空白組相比,模型組、熊去氧膽酸組和胡椒堿低、中劑量組ABCG5的蛋白表達(dá)明顯上升(P0.05);與模型組相比,熊去氧膽酸組、胡椒堿中、高劑量組ABCG5的蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低劑量組ABCG5的蛋白表達(dá)明顯升高(P0.05),胡椒堿高劑量組ABCG5的蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05)。3.4各組小鼠肝臟組織ABCG8的蛋白表達(dá)比較 與空白組相比,模型組、熊去氧膽酸組和胡椒堿低、中劑量組ABCG8的蛋白表達(dá)明顯上升(P0.05);與模型組相比,熊去氧膽酸組、胡椒堿中、高劑量組ABCG8的蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低劑量組ABCG8的蛋白表達(dá)明顯升高(P0.05)。3.5各組小鼠肝臟組織LRH-1的mRNA表達(dá)比較 與空白組相比,模型組、熊去氧膽酸組、胡椒堿低、中、高劑量組LRH-1的mRNA表達(dá)明顯上升(P0.05);與模型組相比,熊去氧膽酸組、胡椒堿中、高劑量組LRH-1的mRNA表達(dá)明顯下降(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低、中劑量組LRH-1、的mRNA表達(dá)明顯升高(P0.05)。3.6各組小鼠肝臟組織SRBI的mRNA表達(dá)比較 與空白組相比,模型組、胡椒堿低、中劑量組SRBI的mRNA表達(dá)明顯上升(P0.05);與模型組相比,熊去氧膽酸組、胡椒堿中、高劑量組SRBI的mRNA表達(dá)明顯下降(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低、中劑量組SRBI的mRNA表達(dá)明顯升高(P0.05)。3.7各組小鼠肝臟組織ABCG5的mRNA表達(dá)比較 與空白組相比,模型組、胡椒堿低、中劑量組ABCG5的mRNA表達(dá)明顯上升(P0.05);與模型組相比,熊去氧膽酸組、胡椒堿中、高劑量組ABCG5的mRNA表達(dá)明顯下降(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低劑量組ABCG5的mRNA表達(dá)明顯升高(P0.05)。3.8各組小鼠肝臟組織ABCG8的mRNA表達(dá)比較 與空白組相比,模型組、胡椒堿低、中、高劑量組ABCG8的mRNA表達(dá)明顯上升(P0.05);與模型組相比,熊去氧膽酸組、胡椒堿中、高劑量組ABCG8的mRNA表達(dá)明顯下降(P0.05);與熊去氧膽酸組相比,胡椒堿低、中劑量組ABCG8的mRNA表達(dá)明顯升高(P0.05)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察胡椒堿對(duì)C57BL/6小鼠膽固醇結(jié)石形成的影響,證實(shí)胡椒堿中、高(40mg·kg-1,60mg·kg-1)劑量組可能通過(guò)抑制肝臟組織LRH-1/SRBI及LRH-1/ABCG5/ABCG8信號(hào)通路的表達(dá),改善血清中的脂質(zhì)代謝異常,進(jìn)而能夠抑制高脂飼料誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠膽囊膽固醇結(jié)石的形成,且胡椒堿高劑量組優(yōu)于胡椒堿中劑量組。
【圖文】：

其余各組與模型組相比，，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組小鼠膽固醇結(jié)石率比較見(jiàn)表 1。圖1 空白組與模型組膽囊結(jié)石成石狀態(tài)注：A：空白組，B：模型組

圖 2 各組小鼠膽囊容積比較（n=15，x±s）注：aP<0.05 與空白組相比；bP<0.05 與模型組相比；cP<0.05 與熊去氧膽酸組相比。.各組小鼠膽囊膽汁 CSI 水平比較與空白組相比，模型組、熊去氧膽酸組、胡椒堿組 CSI 數(shù)值出現(xiàn)明顯升高（P＜0.05
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2647127