【摘要】：目的:卒中具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率等特性,是歐美國家第二大死亡原因,在中國,卒中是人類死亡的最主要原因,急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,AIS)約占全部卒中的80%。目前卒中的研究聚焦于如何高效的修復(fù)AIS后神經(jīng)損傷。以前人們往往覺得大腦中的神經(jīng)元是不具備再生能力的。神經(jīng)干細胞(Neural stem cells,NSCs)的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)修復(fù)帶來新希望。開竅醒神中藥麝香廣泛用于缺血中風(fēng)治療,但其促進神經(jīng)再生的機制尚不明確。本研究運用腦缺血/再灌注(MCAO)模型,采用分子生物學(xué)、干細胞等技術(shù),觀察“開竅醒神“法對于內(nèi)源性NSC增殖分化的影響,分析“開竅醒神”法干預(yù)內(nèi)源性NSC增殖分化的分子機制,揭示中醫(yī)“開竅醒神”法實質(zhì),豐富中醫(yī)治療中風(fēng)病的理論。方法:1.實驗動物SPF級雌性SD大鼠90只,體重250-300 g,按隨機數(shù)字表分為6組,高、中、低濃度組各24只,再分為1、3、7、14d組,假手術(shù)組、模型組、空白對照組各6只。模型組、假手術(shù)組、空白對照組給予生理鹽水灌胃,麝香酮高、中、低劑量組分別給予1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg灌胃,按10ml/kg體重的體積灌胃給藥,每日灌胃1次。2.麝香酮對MCAO大鼠側(cè)腦室下區(qū)GFAP、Neu-N蛋白表達的影響復(fù)制大鼠 MCAO模型,高(16.8μL/100g)中(8.2μL/100g)低(4.2μμL/100 g)劑量麝香酮混懸液連續(xù)灌胃1d、3d、7d、14d后處死,分離側(cè)腦室下區(qū)(subventricular zone,SVZ)腦組織,蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測神經(jīng)元特異性核蛋白Neu-N、膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP蛋白表達,用Image Lab顯影成像并進行數(shù)據(jù)分析,比較分析各組大鼠蛋白表達的差異。3.麝香酮對MCAO大鼠側(cè)腦室下區(qū)GFAP、Neu-N細胞增殖分化的影響復(fù)制大鼠 MCAO模型,高(16.8μ L/100g)中(8.2μL/100g)低(4.2μL/100 g)劑量麝香酮混懸液連續(xù)灌胃1d、3d、7d、14d后處死,分離側(cè)腦室下區(qū)腦組織,多聚甲醛固定、包埋及切片后進行免疫熒光染色,熒光顯微鏡下觀察,分析各組大鼠神經(jīng)元標志物Neu-n、星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP 陽性細胞計數(shù)的表達差異。結(jié)果:1.麝香酮對MCAO大鼠側(cè)腦室下區(qū)GFAP、Neu-N蛋白表達的影響蛋白印跡結(jié)果提示,在MCAO大鼠SVZ區(qū)發(fā)現(xiàn)有GFAP、Neu-N蛋白的增殖,與模型組比較,中高濃度組GFAP、Neu-N蛋白表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),可見不同濃度的麝香酮作用于MCAO大鼠,GFAP蛋白表達隨藥物濃度的遞增而呈遞減趨勢,Neu-N蛋白表達隨藥物濃度的遞增而呈遞增趨勢。在MCAO大鼠側(cè)腦室發(fā)現(xiàn)有GFAP、Neu-N蛋白的沉積;麝香酮呈濃度依賴性下調(diào)MCAO大鼠側(cè)腦室GFAP蛋白表達;麝香酮呈濃度依賴性上調(diào)MCAO大鼠側(cè)腦室Neu-N蛋白的表達。2.麝香酮對MCAO大鼠側(cè)腦室下區(qū)GFAP、Neu-N細胞增殖分化的影響結(jié)果顯示,星形膠質(zhì)細胞計數(shù)依次為:高濃度麝香酮組(33.67±5.86)個/視野、中濃度麝香酮組(39.67±5.13)個/視野、低濃度麝香酮組(55.33±2.31)個/視野、模型組(50.67 ±2.08)個/視野、假手術(shù)組(56.33 ±9.0)個/視野、空白對照組(58.33± 1.53)個/視野,與空白對照組比較,模型組、低濃度麝香酮組大鼠星型膠質(zhì)細胞激活計數(shù)明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與模型組大鼠比較,中高濃度麝香酮組大鼠的星形膠質(zhì)細胞激活數(shù)顯著減少,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。神經(jīng)元細胞計數(shù)依次為:高濃度麝香酮組(110.67±37.2)個/視野、中濃度麝香酮組(91.33±36.95)個/視野、低濃度麝香酮組(69.33±20.79)個/視野、模型組(54.33±13.15)個/視野、假手術(shù)組(24.33±8.62)個/視野、空白對照組(12.33±9.29)個/視野,與空白對照組比較,模型組、低濃度麝香酮組大鼠神經(jīng)元細胞激活計數(shù)明顯增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與模型組大鼠比較,高濃度麝香酮組大鼠的星形膠質(zhì)細胞計數(shù)顯著增多,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:1、腦缺血再灌注后大鼠腦組織自發(fā)地促進神經(jīng)干細胞的增殖,可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞向缺血區(qū)皮質(zhì)和紋狀體遷移,從而分化為神經(jīng)元(Neu-N標記的陽性細胞)和神經(jīng)膠質(zhì)細胞(GFAP標記的陽性細胞),但數(shù)目較少。2、經(jīng)麝香酮灌胃治療后,內(nèi)源性NSCs增殖明顯,并分化為神經(jīng)元,而分化為星形膠質(zhì)細胞數(shù)量較模型對照組少。3、麝香酮能促進MCAO大鼠ENSCs的增殖,并且使神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化增加,減少神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞的分化;高濃度麝香酮具有更強的促進NSC增殖分化的能力。
【圖文】：

高濃度組ＧＦＡＰ、Ｎｅｕ－Ｎ蛋白表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（戶＜０．０１），可見不同逡逑濃度的麝香酮作用于ＭＣＡ０大鼠，，ＧＦＡＰ蛋白表達隨藥物濃度的遞增而呈遞減趨勢，逡逑Ｎｅｕ－Ｎ蛋白表達隨藥物濃度的遞增而呈遞增趨勢。詳見表１、圖２。逡逑表１麝香酮對ＭＣＡ０大鼠ＳＶＺ區(qū)ＧＦＡＰ、Ｎｅｕ－Ｎ蛋白表達影響（３Ｆ±ｘ，ｎ＝３）逡逑Ｍ３１邐ｉｉＳ邐Ｎｅｕ－ｎ邐ＧＦＡＰ逡逑／ｍｇ邋？邋ｋｇ逡逑邐＾邐逡逑麝香酮高濃度邐４邐１．４３邋＋邋０．０７邐１．００＋０．００逡逑組逡逑麝香酮中濃度邐２邐１．０８±０．２４邐１．６０±０．４３逡逑組逡逑麝香酮低濃度邐１邐０．９２±０．５２邐３．２０±１．３７逡逑組逡逑模型＋ＮＳ邋組邐－邐０．５９±０．邋１０邐０．０６±０．０９逡逑假手術(shù)組邐－邐０．５２±０．４５邐０．６７±０．邋１０逡逑空白對照組邐－邐０．５１±０．１０邐２．９４±０．邋１０逡逑廠值邐１１．５７８邐３．１７４逡逑尸值邐０．０００邐０．０４７逡逑注：與模型組比較，ＧＦＡＰ蛋白低、中濃度組尸值為０．邋０２０、０．０１７，★Ｐ＜０．邋０５，高濃度組尸值為逡逑０．００１，邐與模型組比較，Ｎｅｕ－Ｎ中濃度組Ｐ值為０．０１２，邋＊Ｐ＜０．０５，低、高濃度組b6逡逑值為邋０．０００、０．００１，邋＊＊戶＜０＿邋０１。逡逑２４逡逑

圖５各組大鼠星型膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元細胞計數(shù)逡逑注：Ａ：星型膠質(zhì)細胞計數(shù)；Ｂ：神經(jīng)元細胞計數(shù)；與正常組比較，Ｆ＜０．邋０１；與模型組比較，逡逑０．邋０１；逡逑六、討論逡逑大腦動脈阻塞或腦部血管破裂導(dǎo)致急性腦血管幨件發(fā)牛，｜〖｜丨６腦血符疾病發(fā)牛．。逡逑缺少白細胞血小板的血液流向大腦隨后導(dǎo)致細胞死亡。腦血管疾病＋：要有以卜３種：逡逑缺血性中風(fēng)，出血性中風(fēng)和短暫性腦缺血發(fā)作（Ｔ】Ａ）。腦血管疾病的高發(fā)病率在世界范逡逑圍內(nèi)很大程度上是由于失畋的管理和預(yù)防可緩和的危險因索，尤其是在缺血性中風(fēng)中，逡逑占〉腦血管疾病總數(shù)的８；５％。腦血管疾病更常見的影響超重的人，年齡彡５５歲，有－個逡逑３３逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2646084