【摘要】：肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其中來(lái)源于肝細(xì)胞的肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最為常見(jiàn)。肝癌一般是由慢性肝病引起的肝細(xì)胞損傷,如慢性肝炎導(dǎo)致的肝組織纖維化、肝硬化,最后導(dǎo)致肝細(xì)胞癌。傳統(tǒng)的治療手段有手術(shù)、介入、放療、化療以及生物免疫治療等。尋找有效的治療藥物,并對(duì)肝病的發(fā)病機(jī)理和藥物的作用機(jī)制進(jìn)行研究,是非常受重視的研究方向之一�？鄥A(Matrine)是從豆科屬植物苦參的干燥根中分離出來(lái)的生物堿,具有廣泛的藥理學(xué)活性,如抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗心律失常、抗肝纖維化、抗腫瘤活性,在臨床上可以治療肝纖維化,慢性乙肝等疾病�？鄥A抗腫瘤活性的機(jī)制是多方面的,如抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲,抑制腫瘤組織內(nèi)部微血管的生成,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化等,并且具有免疫調(diào)節(jié)以及降低化療、放療帶來(lái)的毒性等作用。M-19是近年來(lái)重點(diǎn)研究的一個(gè)新型硫代苦參堿衍生物,其藥理活性廣泛,尤其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制活性,其活性遠(yuǎn)強(qiáng)于苦參堿,但是M-19有與苦參堿一樣的缺點(diǎn),水溶性好,它的穩(wěn)定性還不如苦參堿,很容易分解。在前期研究的基礎(chǔ)之上,我們以苦參堿和苦參堿衍生物M-19為先導(dǎo)化合物,以槐果堿為起始原料,保留基本藥效基團(tuán),向結(jié)構(gòu)中引入藥物設(shè)計(jì)中常見(jiàn)的有效結(jié)構(gòu)片段,合成了多個(gè)系列的新化合物,并從中篩選到了編號(hào)為WM622的高活性、低毒性的新型苦參堿衍生物。我們對(duì)化合物WM622進(jìn)行了深入的藥理研究,發(fā)現(xiàn)其對(duì)HCC-LM3和Hep3B細(xì)胞有很好的活性。在體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,WM622對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖有著顯著的抑制作用,能夠抑制腫瘤細(xì)胞遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的藥物設(shè)計(jì)的手段,對(duì)WM622與靶點(diǎn)蛋白的作用進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接,推測(cè)其與EGFR和PTEN蛋白結(jié)合的匹配性較好,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其對(duì)EGFR-AKT/PI3K通路具有抑制作用。在荷瘤小鼠體內(nèi),WM622對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。從而為抗肝癌藥物的研究提供了新的機(jī)理和研究基礎(chǔ)。研究方法:1、苦參堿衍生物的合成以及抗腫瘤活性篩選。我們以苦參堿和苦參堿衍生物M-19為先導(dǎo)化合物,合成了三類(lèi)新型苦參堿衍生物,并用MTT法測(cè)定了0.1mg/mL濃度下各個(gè)化合物對(duì)不同肝癌細(xì)胞系的抑制率,篩選出對(duì)肝癌細(xì)胞有抑制作用的化合物。檢測(cè)并計(jì)算這一批化合物對(duì)肝癌細(xì)胞的IC_(50),篩選出抗腫瘤活性高的化合物和敏感細(xì)胞系。2、WM622體外抑制肝癌細(xì)胞以及肝癌干細(xì)胞作用的研究。為了檢測(cè)WM622對(duì)肝癌細(xì)胞以及肝癌干細(xì)胞的抑制作用,我們從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究:(1)通過(guò)MTT比色法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn),檢測(cè)WM622對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的作用;(2)通過(guò)細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn),檢測(cè)WM622對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的作用;(3)通過(guò)Hoechst 33258染色以及PI、AV/FITC雙染的方法,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WM622處理過(guò)的腫瘤細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占的比例,評(píng)價(jià)WM622對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的作用;(4)通過(guò)PI染色以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WM622處理過(guò)的腫瘤細(xì)胞中各個(gè)周期細(xì)胞所占的比例,分析WM622對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響;(5)通過(guò)磁珠分選的方法,獲得CD133~+細(xì)胞系,通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證其干性,檢測(cè)WM622對(duì)CD133~+和CD133~-細(xì)胞成球和細(xì)胞增殖的影響。3、WM622抑制肝癌細(xì)胞分子機(jī)制的研究。我們先通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的方法,尋找WM622可能作用的靶點(diǎn)蛋白和信號(hào)通路。然后用Western Blot的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,研究WM622在抗癌過(guò)程中的具體機(jī)制。4、WM622體內(nèi)抗肝癌作用效果的研究。我們先將HCC-LM3細(xì)胞懸液皮下注射于四周齡的BALB/c裸鼠背部,建立BALB/c裸鼠成瘤模型。設(shè)置高濃度藥物組(34mg/kg)、低濃度藥物組(17 mg/kg)、5-Fu組(20 mg/kg)及空白對(duì)照組(PBS),隔一天進(jìn)行腹腔注射給藥。給藥10次后采取小鼠腫瘤組織,繪制腫瘤增長(zhǎng)曲線和小鼠體重變化曲線。組織切片HE染色的方法觀察腫瘤組織結(jié)構(gòu)。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色,以及Western Blot的方法,檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量變化。研究結(jié)果:1、苦參堿衍生物的合成以及抗腫瘤活性篩選。我們合成了三類(lèi)苦參堿衍生物,MTT法檢測(cè)了各個(gè)化合物在0.1 mg/mL的濃度下對(duì)6種肝癌細(xì)胞系的抑制率。分別計(jì)算這批化合物對(duì)4種肝癌細(xì)胞的IC_(50),從中篩選出了抗腫瘤活性最好的化合物WM622以及敏感細(xì)胞系HCC-LM3和Hep3B。2、WM622體外抑制肝癌細(xì)胞以及肝癌干細(xì)胞作用的研究。這部分的研究中,我們得到以下結(jié)論:(1)WM622對(duì)肝癌細(xì)胞系HCC-LM3和Hep3B的抑制率隨著濃度和時(shí)間的增加而升高,對(duì)正常肝細(xì)胞系的毒性低于對(duì)肝癌細(xì)胞系的毒性,隨著WM622濃度的增加,HCC-LM3和Hep3B的平板克隆形成率顯著下降;(2)隨著WM622濃度的增加,HCC-LM3和Hep3B的劃痕實(shí)驗(yàn)愈合面積顯著減少,Transwell細(xì)胞數(shù)顯著減少;(3)經(jīng)Hoechst 33258染色后,熒光顯微鏡下觀察到凋亡細(xì)胞的亮白色呈分散的碎顆粒狀或棒狀細(xì)胞核,隨著WM622濃度的增加,凋亡細(xì)胞的數(shù)目逐漸增多;(4)PI和AV-FITC染色后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的凋亡細(xì)胞所占的比例增多,G1期細(xì)胞所占的比例增加,提示W(wǎng)M622能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻滯在G0/G1期;(5)通過(guò)磁珠分選的方法,將肝癌細(xì)胞系分為CD133~+細(xì)胞和CD133~-細(xì)胞,CD133~+細(xì)胞的成球率顯著高于CD133~-細(xì)胞。WM622能夠濃度依賴地抑制CD133~+細(xì)胞的成球和增殖能力。3、WM622抑制肝癌細(xì)胞分子機(jī)制的研究。我們通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的方法,推測(cè)出了WM622與EGFR、PTEN結(jié)合的匹配性較好,并用Western Blot的方法進(jìn)一步驗(yàn)證了WM622能夠抑制腫瘤細(xì)胞的EGFR-PI3K/AKT通路。4、WM622體內(nèi)抗肝癌作用效果的研究。我們得出,隨著WM622給藥時(shí)間的延長(zhǎng),可以看到腫瘤體積增長(zhǎng)幅度越來(lái)越小。光鏡下觀察腫瘤組織的HE染色切片,可見(jiàn)細(xì)胞核質(zhì)比大,胞核深染,組織結(jié)構(gòu)散亂等腫瘤組織的一般形態(tài)學(xué)特征。通過(guò)免疫組織化學(xué)和Western Blot的方法,驗(yàn)證了WM622能夠抑制腫瘤細(xì)胞的EGFR-PI3K/AKT通路。結(jié)論:在體外,WM622能夠劑量和時(shí)間依賴地抑制肝癌細(xì)胞系HCC-LM3和Hep3B的增殖、遷移,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,將腫瘤細(xì)胞的周期阻滯在G0/G1期。能夠抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖。在體內(nèi),WM622能夠劑量依賴地抑制腫瘤的生長(zhǎng)。WM622作用的機(jī)制是抑制腫瘤細(xì)胞的EGFR-PI3K/AKT通路。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2646055