【摘要】：肝癌是常見的惡性腫瘤之一,其中來源于肝細胞的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最為常見。肝癌一般是由慢性肝病引起的肝細胞損傷,如慢性肝炎導致的肝組織纖維化、肝硬化,最后導致肝細胞癌。傳統(tǒng)的治療手段有手術、介入、放療、化療以及生物免疫治療等。尋找有效的治療藥物,并對肝病的發(fā)病機理和藥物的作用機制進行研究,是非常受重視的研究方向之一。苦參堿(Matrine)是從豆科屬植物苦參的干燥根中分離出來的生物堿,具有廣泛的藥理學活性,如抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗心律失常、抗肝纖維化、抗腫瘤活性,在臨床上可以治療肝纖維化,慢性乙肝等疾病�？鄥A抗腫瘤活性的機制是多方面的,如抑制腫瘤細胞的增殖,促進細胞凋亡,抑制腫瘤細胞的侵襲,抑制腫瘤組織內(nèi)部微血管的生成,誘導腫瘤細胞分化等,并且具有免疫調(diào)節(jié)以及降低化療、放療帶來的毒性等作用。M-19是近年來重點研究的一個新型硫代苦參堿衍生物,其藥理活性廣泛,尤其對多種腫瘤細胞具有較強的抑制活性,其活性遠強于苦參堿,但是M-19有與苦參堿一樣的缺點,水溶性好,它的穩(wěn)定性還不如苦參堿,很容易分解。在前期研究的基礎之上,我們以苦參堿和苦參堿衍生物M-19為先導化合物,以槐果堿為起始原料,保留基本藥效基團,向結構中引入藥物設計中常見的有效結構片段,合成了多個系列的新化合物,并從中篩選到了編號為WM622的高活性、低毒性的新型苦參堿衍生物。我們對化合物WM622進行了深入的藥理研究,發(fā)現(xiàn)其對HCC-LM3和Hep3B細胞有很好的活性。在體外的細胞實驗中,WM622對肝癌細胞的增殖有著顯著的抑制作用,能夠抑制腫瘤細胞遷移,促進細胞凋亡,將細胞周期阻滯在G0/G1期。通過計算機輔助的藥物設計的手段,對WM622與靶點蛋白的作用進行了計算機模擬對接,推測其與EGFR和PTEN蛋白結合的匹配性較好,并通過實驗證實了其對EGFR-AKT/PI3K通路具有抑制作用。在荷瘤小鼠體內(nèi),WM622對腫瘤的生長有明顯的抑制作用。從而為抗肝癌藥物的研究提供了新的機理和研究基礎。研究方法:1、苦參堿衍生物的合成以及抗腫瘤活性篩選。我們以苦參堿和苦參堿衍生物M-19為先導化合物,合成了三類新型苦參堿衍生物,并用MTT法測定了0.1mg/mL濃度下各個化合物對不同肝癌細胞系的抑制率,篩選出對肝癌細胞有抑制作用的化合物。檢測并計算這一批化合物對肝癌細胞的IC_(50),篩選出抗腫瘤活性高的化合物和敏感細胞系。2、WM622體外抑制肝癌細胞以及肝癌干細胞作用的研究。為了檢測WM622對肝癌細胞以及肝癌干細胞的抑制作用,我們從以下幾個方面進行了研究:(1)通過MTT比色法和平板克隆形成實驗,檢測WM622對肝癌細胞增殖的作用;(2)通過細胞劃痕愈合實驗和Transwell小室實驗,檢測WM622對肝癌細胞遷移的作用;(3)通過Hoechst 33258染色以及PI、AV/FITC雙染的方法,使用流式細胞術檢測WM622處理過的腫瘤細胞中凋亡細胞所占的比例,評價WM622對肝癌細胞凋亡的作用;(4)通過PI染色以及流式細胞術檢測WM622處理過的腫瘤細胞中各個周期細胞所占的比例,分析WM622對肝癌細胞周期的影響;(5)通過磁珠分選的方法,獲得CD133~+細胞系,通過成球?qū)嶒烌炞C其干性,檢測WM622對CD133~+和CD133~-細胞成球和細胞增殖的影響。3、WM622抑制肝癌細胞分子機制的研究。我們先通過計算機輔助藥物設計的方法,尋找WM622可能作用的靶點蛋白和信號通路。然后用Western Blot的方法對結果進行驗證,研究WM622在抗癌過程中的具體機制。4、WM622體內(nèi)抗肝癌作用效果的研究。我們先將HCC-LM3細胞懸液皮下注射于四周齡的BALB/c裸鼠背部,建立BALB/c裸鼠成瘤模型。設置高濃度藥物組(34mg/kg)、低濃度藥物組(17 mg/kg)、5-Fu組(20 mg/kg)及空白對照組(PBS),隔一天進行腹腔注射給藥。給藥10次后采取小鼠腫瘤組織,繪制腫瘤增長曲線和小鼠體重變化曲線。組織切片HE染色的方法觀察腫瘤組織結構。通過免疫組織化學染色,以及Western Blot的方法,檢測腫瘤組織中相關通路關鍵蛋白的表達量變化。研究結果:1、苦參堿衍生物的合成以及抗腫瘤活性篩選。我們合成了三類苦參堿衍生物,MTT法檢測了各個化合物在0.1 mg/mL的濃度下對6種肝癌細胞系的抑制率。分別計算這批化合物對4種肝癌細胞的IC_(50),從中篩選出了抗腫瘤活性最好的化合物WM622以及敏感細胞系HCC-LM3和Hep3B。2、WM622體外抑制肝癌細胞以及肝癌干細胞作用的研究。這部分的研究中,我們得到以下結論:(1)WM622對肝癌細胞系HCC-LM3和Hep3B的抑制率隨著濃度和時間的增加而升高,對正常肝細胞系的毒性低于對肝癌細胞系的毒性,隨著WM622濃度的增加,HCC-LM3和Hep3B的平板克隆形成率顯著下降;(2)隨著WM622濃度的增加,HCC-LM3和Hep3B的劃痕實驗愈合面積顯著減少,Transwell細胞數(shù)顯著減少;(3)經(jīng)Hoechst 33258染色后,熒光顯微鏡下觀察到凋亡細胞的亮白色呈分散的碎顆粒狀或棒狀細胞核,隨著WM622濃度的增加,凋亡細胞的數(shù)目逐漸增多;(4)PI和AV-FITC染色后,流式細胞儀檢測到的凋亡細胞所占的比例增多,G1期細胞所占的比例增加,提示W(wǎng)M622能夠?qū)⒓毎芷谧铚贕0/G1期;(5)通過磁珠分選的方法,將肝癌細胞系分為CD133~+細胞和CD133~-細胞,CD133~+細胞的成球率顯著高于CD133~-細胞。WM622能夠濃度依賴地抑制CD133~+細胞的成球和增殖能力。3、WM622抑制肝癌細胞分子機制的研究。我們通過計算機輔助藥物設計的方法,推測出了WM622與EGFR、PTEN結合的匹配性較好,并用Western Blot的方法進一步驗證了WM622能夠抑制腫瘤細胞的EGFR-PI3K/AKT通路。4、WM622體內(nèi)抗肝癌作用效果的研究。我們得出,隨著WM622給藥時間的延長,可以看到腫瘤體積增長幅度越來越小。光鏡下觀察腫瘤組織的HE染色切片,可見細胞核質(zhì)比大,胞核深染,組織結構散亂等腫瘤組織的一般形態(tài)學特征。通過免疫組織化學和Western Blot的方法,驗證了WM622能夠抑制腫瘤細胞的EGFR-PI3K/AKT通路。結論:在體外,WM622能夠劑量和時間依賴地抑制肝癌細胞系HCC-LM3和Hep3B的增殖、遷移,促進腫瘤細胞的凋亡,將腫瘤細胞的周期阻滯在G0/G1期。能夠抑制腫瘤干細胞的增殖。在體內(nèi),WM622能夠劑量依賴地抑制腫瘤的生長。WM622作用的機制是抑制腫瘤細胞的EGFR-PI3K/AKT通路。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2646055