【摘要】：目的:1.探討Notch信號通路對HaCaT細(xì)胞(人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系)增殖和分化的影響;2.分析Notch信號通路在銀屑病皮損區(qū)皮膚組織中的表達(dá)情況;3.評價龍膽瀉肝湯加減對豚鼠銀屑病樣皮損Notchl、Jaggedl和Hes-1表達(dá)的影響。方法:1.以角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞為研究對象,分別采用MTT法、流式細(xì)胞技術(shù)、Western blot技術(shù)檢測Notch信號通路激活劑(Jaggedl-Fc融合蛋白)和Notch信號通路抑制劑(DAPT)對HaCaT細(xì)胞增殖、凋亡和分化的影響。2.采用實(shí)時熒光定量RT-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測銀屑病患者皮損區(qū)皮膚組織Notchl、Jaggedl和Hes-lmRNA和蛋白的表達(dá)情況。3.選取80只豚鼠,用5%普萘洛爾乳劑外涂豚鼠耳背制備銀屑病樣病理改變模型,設(shè)置空白組、模型組、西藥對照組、成藥對照組及龍膽瀉肝湯加減低、中、高劑量治療組,行普通病理切片HE染色檢測皮損病理改變Baker評分及炎癥細(xì)胞浸潤情況;免疫組化技術(shù)檢測皮損組織Notchl、Jaggedl和Hes-1在細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果:1.MTT結(jié)果顯示,與對照組相比,Jaggedl-Fc融合蛋白處理組的吸光度值明顯增高(P0.05),表明Jaggedl-Fc融合蛋白能夠明顯促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,Jaggedl-Fc融合蛋白處理組的細(xì)胞凋亡率為4.76±1.13,顯著低于對照組(13.69±2.05)(P0.01),DAPT處理組的細(xì)胞凋亡率為26.87±3.18,與對照組相比差異顯著(P0.01)。說明激活Notch信號通路能夠抑制HaCaT細(xì)胞凋亡,阻斷Notch信號通路能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡。Western blot結(jié)果顯示:.Jaggedl-Fc融合蛋白能夠明顯促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)(P0.01),抑制Bax蛋白表達(dá)(P0.01);DAPT則能夠明顯抑制Bcl-2蛋白表達(dá)(P0.01),促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)(P0.01)。Jaggedl-Fc融合蛋白能夠明顯抑制Keratinl和Involucrin蛋白表達(dá)(P0.05),DAPT則能夠明顯促進(jìn)Keratinl和Involucrin蛋白表達(dá)(P0.05)。2.患病組皮損處Notchl、Jaggedl和Hes-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著高于對照組和正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),對照組與正常組相比Notchl、Jaggedl和Hes-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平無顯著性差異(P0.05)。提示Notch信號通路的激活與銀屑病的發(fā)生密切相關(guān)。3.模型組和其余各組相比,Baker評分和炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)評分均有顯著性差異(P0.01),提示模型制備成功。西藥對照組Barker評分和細(xì)胞浸潤情況低于成藥對照組(P＜0.05),西藥對照組與中劑量組兩者評分接近(P＞0.05),成藥組與低、高劑量組情況接近(P0.05)。中劑量組與西藥對照組鏡下均可見角化不全、過度現(xiàn)象減輕,表皮突變平,棘層變薄等征象。免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組的Notchl、jaggedl和Hes-1的表達(dá)水平顯著高于其他各組。龍膽瀉肝湯加減中劑量組與西藥對照組三種蛋白的表達(dá)量相當(dāng),且顯著高于龍膽瀉肝湯加減高、低劑量組與成藥對照組。結(jié)論:1.Notch信號通路參與了 HaCaT細(xì)胞的增殖和分化,激活Notch信號通路能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖、抑制HaCaT細(xì)胞的凋亡和分化。反之,阻斷Notch信號通路能夠抑制HaCaT細(xì)胞的增殖、促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的凋亡和分化。2.Notch信號通路參與HaCaT細(xì)胞的凋亡可能與調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)有關(guān),Notch信號通路參與HaCaT細(xì)胞的分化可能與調(diào)控Keratinl和Involucrin蛋白表達(dá)有關(guān)。3.Notch信號通路關(guān)鍵因子在銀屑病患者皮損區(qū)皮膚組織中表達(dá)上調(diào),Notch信號通路的激活與銀屑病的發(fā)生密切相關(guān)。4.中劑量龍膽瀉肝湯加減(4.5g/kg)對銀屑病的治療效果較好,其可能是通過調(diào)控Notchl、Jaggedl和Hes-1的表達(dá)量抑制微血管生成達(dá)到治療銀屑病的目的。
【圖文】：

用ＳＰＳＳ２１．０統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，定量結(jié)果用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差逡逑（［士ｓ）表示。通過單因素方差分析來比較組間差異，以Ｐ＜０．０５，邋Ｐ＜０．０１為差異逡逑具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑（？）邋Ｎｏｔｃｈ信號通路對ＨａＣａＴ細(xì)胞增殖的影響逡逑Ｊａｇｇｅｄ邋１－Ｆｃ融合蛋白能夠特異性激活Ｎｏｔｃｈ信號通路，而ＤＡＰＴ對Ｎｏｔｃｈ信號通逡逑路具有阻斷和抑制的作用，ＭＴＴ實(shí)驗(yàn)檢測用ｊａｇｇｅｄｌ－Ｆｃ融合蛋白激活和用ＤＡＰＴ阻逡逑斷Ｎｏｔｃｈ信號通路對ＨａＣａＴ細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果如圖１所示，，Ｊａｇｇｅｄｌ－Ｆｃ融合蛋逡逑白能夠明顯促進(jìn)ＨａＣａＴ細(xì)胞增殖，與０卜ｉｇ／ｍｌ組相比差異顯著（Ｐ＜０．０１），邋ＤＡＰＴ則逡逑能夠抑制ＨａＣａＴ細(xì)胞增殖，與Ｏｐｍｏｌ／Ｌ組相比差異顯著０．０５），且都具有劑量逡逑和T間依賴性。說明激活Ｎｏｔｃｈ信號迎路能夠促進(jìn)ＨａＣａＴ細(xì)胞增殖，阻斷Ｎｏｔｃｈ信逡逑號迎路能夠抑制ＨａＣａＴ細(xì)胞增殖。逡逑

邐山東中醫(yī)藥大學(xué)２０１７屆博士學(xué)位論文（二）Ｎｏｔｃｈ信號通路對ＨａＣａＴ細(xì)胞凋亡的影響逡逑用流式細(xì)胞術(shù)檢測ＤＡＰＴ和Ｊａｇｇｅｄｌ－Ｆｃ對Ｎｏｔｃｈ信號通路的影響以及對ＨａＣａＴ細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果如表１和圖２所示，Ｊａｇｇｅｄｌ－Ｆｃ融合蛋白能夠明顯抑制ＨａＣａＴ細(xì)胞凋亡，與空白對照組相比差異顯著（／＾〈Ｏ．Ｏｌ），ＤＡＰＴ則能夠明顯促進(jìn)ＨａＣａ細(xì)胞凋亡，與空白對照組相比差異顯著（Ｐ＜邋０．０１）。說明激活Ｎｏｔｃｈ信號通路能夠制ＨａＣａＴ細(xì)胞凋亡，阻斷Ｎｏｔｃｈ信號通路能夠促進(jìn)ＨａＣａＴ細(xì)胞凋亡。逡逑表１邋Ｊａｇｇｅｄ１－Ｆｃ融合蛋白和ＤＡＰＴ對ＨａＣａＴ細(xì)胞凋亡的影響（ｘ土ｓ，邋ｎ＝６）逡逑組別邐細(xì)胞凋亡率逡逑對照組邐１３．邋６９±２．邋０５逡逑Ｊａｇｇｅｄｌ－Ｆｃ邐４．邋７６土邋１．１３林逡逑ＤＡＰＴ邐２６．邋８７±３．邋１８林逡逑注：與對照組相比，林Ａ０．０１。逡逑對照組邐Ｊ：ｉＳ２？Ｕ－Ｆｃ邐ＤＡＰＴ逡逑ｉｏ４－邐邐１０４－邐邐１0４＂邐邐逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2645280