發(fā)布時間：2020-04-28 11:56

【摘要】：目的:觀察大鼠脊髓損傷后行為學(xué)和脊髓組織形態(tài)學(xué)的影響,利用高通量測序技術(shù)探討姜黃素對盲腸組織微生物多樣性及代謝通路的影響,同時探究姜黃素對大鼠脊髓損傷后基因表達的影響及通路,為姜黃素可用于治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。方法:1、使用HI-0400脊髓打擊器制備SD大鼠脊髓損傷模型,分為5組:(1)假手術(shù)對照組(Sham)10只,脊髓損傷模型組(SCI)、模型+姜黃素組(CUR 50 mg/kg)、模型+姜黃素組(CUR 100 mg/kg)、模型+姜黃素組(CUR 200 mg/kg)共4組,每組各10只。分別在術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d采用神經(jīng)功能學(xué)BBB評分及Rivlin斜板試驗對大鼠進行行為學(xué)評價,HE染色觀察大鼠脊髓組織形態(tài)學(xué)的變化;2、術(shù)后14 d通過主動脈灌注后,取Sham組、SCI組和CUR組大鼠的盲腸組織,提取組織中微生物的總DNA,對16S rDNA的V3+V4可變區(qū)進行高通量測序,通過分析α及β多樣性、菌群的相對豐富程度、LEfSE法尋找差異物種,分析姜黃素對大鼠脊髓損傷后微生物菌群多樣性的影響。通過KEGG代謝途徑分析姜黃素促進大鼠脊髓損傷修復(fù)的可能代謝通路;3、術(shù)后14 d通過主動脈灌注后,采用Illumina測序平臺對大鼠脊髓進行轉(zhuǎn)錄組測序,對靶點進行表達量統(tǒng)計,分析Sham組、SCI組和CUR組三組大鼠基因表達的差異,篩選差異表達基因,通過KEGG功能分析對相關(guān)基因進行注釋,獲得核心富集基因,從而分析姜黃素對大鼠脊髓后基因表達的影響及可能的作用機制。結(jié)果1、大鼠行為學(xué):通過BBB評分、斜板試驗發(fā)現(xiàn)大鼠脊髓損傷5 d后,BBB評分和斜板試驗角度均有上升,姜黃素給藥組顯著高于模型組,中等劑量100 mg/kg的姜黃素較小劑量50 mg/kg改善效果明顯,具有顯著性差異(P0.05);與大劑量(200 mg/kg)比較則無顯著性差異(P0.05)。通過HE染色發(fā)現(xiàn)姜黃素給藥組受損脊髓神經(jīng)元變性壞死和炎性反應(yīng)明顯減輕,組織內(nèi)空腔顯著減少。2、微生物多樣性:(1)菌群差異:脊髓損傷后盲腸組織菌群豐度受影響明顯的菌群包括:厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、腸桿菌科、韋榮球菌科、志賀菌屬、擬桿菌屬等;姜黃素治療脊髓損傷菌群豐度影響明顯的有:ε-擬桿菌門、螺桿菌科、乳酸桿菌科、螺桿菌屬、乳酸桿菌屬等。(2)KEGG分析:Model組與CUR組比較,主要通路差異在碳水化合物代謝、膜轉(zhuǎn)運、細(xì)胞運動、能量代謝、信號傳導(dǎo),其中碳水化合物代謝途徑的差異最為明顯。3、轉(zhuǎn)錄組分析:sham組與SCI組比較:(1)采用DEseq軟件進行差異篩選共得到6394個差異表達基因,其中有3148個基因表達上調(diào),3246個基因表達下調(diào);(2)通過GO功能分析得出差異表達基因富集于24個GO條目中,主要包括代謝進程、生物學(xué)調(diào)節(jié)、細(xì)胞進程、發(fā)育進程、單體、刺激反應(yīng)、細(xì)胞、細(xì)胞組分、結(jié)合、催化活性、分子傳感器活性等;(3)通過KEGG通路途徑分析得到差異表達顯著富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、成骨細(xì)胞分化、MAPK信號通路、軸突導(dǎo)向、細(xì)胞生長和凋亡、細(xì)胞黏附等通路中。Model組與CUR組比較:(1)差異表達基因的數(shù)量為3500,其中上調(diào)基因有1876個;顯著下調(diào)基因有1624個;(2)3028個差異表達基因可以注釋到25個GO條目中,包括細(xì)胞過程、生物學(xué)調(diào)節(jié)、代謝進程、多細(xì)胞生物進程、信號通路、細(xì)胞器、大分子復(fù)合物、細(xì)胞組分、結(jié)合、催化活性、分子傳感器活性等;(3)通過KEGG通路途徑分析得到差異表達基因顯著富集在TNF信號通路、吞噬體、MAPK信號通路、成骨細(xì)胞分化、細(xì)胞黏附分子等通路中。結(jié)論:1.中等劑量姜黃素100 mg/kg經(jīng)腹腔注射可使脊髓損傷后肢體運動功能明顯改善,對受損脊髓有一定的保護及修復(fù)作用;2.大鼠脊髓損傷后腸道菌群多樣性增加,應(yīng)用中等劑量姜黃素后腸道菌群的多樣性及腸道菌群豐度改變,與ε-擬桿菌門、螺桿菌科豐度增高,變形菌門、放線菌門豐度下降有關(guān),極有可能是通過碳水化合物代謝通路實現(xiàn)的。3.SCI組與空白對照組比較共有3148個上調(diào)基因及3246個下調(diào)基因;姜黃素給藥組與SCI組比較共有1876個上調(diào)基因與1624個下調(diào)基因,主要包括炎癥、免疫相關(guān)的基因顯著下調(diào)。姜黃素治療脊髓損傷可能是通過下調(diào)TNF信號通路、吞噬體、MAPK信號通路、成骨細(xì)胞分化、細(xì)胞黏附分子通路等實現(xiàn)的。
【圖文】：

實驗結(jié)果鼠脊髓損傷后觀察術(shù)后 3 h 大鼠清醒，假手術(shù)對照組大鼠后肢關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕微活動，，能夠組大鼠后肢癱瘓，兩個前肢可爬行，無進食及進水需求。術(shù)后 1 d大鼠基本恢復(fù)正常，四肢協(xié)調(diào)性較好，飲食恢復(fù)正常；模型組和姜主要靠前肢拖著身體貼地爬行，身體不平衡，尿潴留嚴(yán)重。術(shù)后 5開始出現(xiàn)后肢運動，但髖膝關(guān)節(jié)及足部諸關(guān)節(jié)均有不同程度僵硬，見明顯后肢活動，少數(shù)大鼠排尿功能恢復(fù)。大鼠未見褥瘡現(xiàn)象，SC現(xiàn)紅腫。在術(shù)后由于排尿時膀胱破裂死亡的大鼠共 4 只：其中 SCI 組 mg/kg）組 1 只，CUR（100 mg/kg）組 1 只，CUR（200 mg/kg）組亡率 8％。

為學(xué)觀察B 評分表 1-2.各組大鼠術(shù)后不同時間點 BBB 評分結(jié)果（ X±S ，n=9）BB scores at different time points after operation in each group of rats（ X ±S，n=9）Sham SCICUR（50mg/kg）CUR（100mg/kg）CUR（200mg/kg）20±0.76 1.3±0.671.4±0.70 1.0±0.82 1.3±0.8220.625±0.52 4.0±1.123.6±1.00 4.0±1.22 4.0±0.8720.5±0.53 6.3±1.126.3±0.87 6.9±1.54 7.0±1.4120.375±0.74 9.0±1.009.5±1.33 11.7±2.12 13.8±2.68*20.125±0.64 10.8±1.0912.5±1.51 17.9±2.67* 17.8±3.15* CUR 組與 SCI 組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）
【學(xué)位授予單位】：延安大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2643434