【摘要】：向日葵(Helianthus annuus L.)的莖芯的水提液在我國(guó)被用于治療晚期惡性腫瘤,表明向日葵的莖芯的水提液含有抗腫瘤的活性物質(zhì)。在尋找向日葵莖芯中抗腫瘤活性物質(zhì)的過(guò)程中,向日葵莖芯多糖被篩選出。并首先對(duì)向日葵莖芯多糖的結(jié)構(gòu)以及抗肺癌轉(zhuǎn)移活性與作用機(jī)制進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:1.向日葵莖芯多糖(HALWP)的制備:首先通過(guò)水提醇沉法提取向日葵莖芯多糖,提取所得粗多糖利用Sevag法除去蛋白、活性炭法除去色素后,上DE-52離子交換層析柱進(jìn)行分離,得到四個(gè)洗脫峰(HALWP1、HALWP2、HALWP3、HALWP4)。將抗腫瘤活性最強(qiáng)的HALWP4上葡聚糖Sephadex G-200層析柱,再次分離得到四個(gè)洗脫峰(HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3 和 HALWP4-4),它們的得率分別占 HALWP4的2.09%、2.06%、3.05%和0.66%。HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3和HALWP4-4通過(guò)高效凝膠排阻色譜檢測(cè)其平均分子質(zhì)量分別為6.85×105 Da,5.42×105 Da,1.66×105Da,1.03×105Da。2.向日葵莖芯多糖的結(jié)構(gòu)初步解析:將向日葵莖芯多糖進(jìn)行完全水解,經(jīng)衍生化后質(zhì)譜分析,結(jié)合紅外光譜及生源推測(cè)組成向日葵莖芯多糖的單糖為β-D-甘露糖、β-D-甘露糖醛酸、β-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖醛酸、β-D-半乳糖或β-D-半乳糖醛酸這三種單糖或其醛酸的一種單糖醛酸或若干種單糖及單糖醛酸,且一定量的單糖通過(guò)甘油與脂肪酸共價(jià)結(jié)合。將HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3和HALWP4-4進(jìn)行完全水解,經(jīng)衍生化后質(zhì)譜分析,結(jié)合紅外光譜及生源推測(cè)組成HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3和HALWP4-4的單糖為β-D-甘露糖、β-D-甘露糖醛酸、β-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖醛酸、β-D-半乳糖或β-D-半乳糖醛酸這三種單糖或其醛酸的一種單糖醛酸或若干種單糖及單糖醛酸,且一定量的單糖通過(guò)甘油與脂肪酸或有機(jī)酸共價(jià)結(jié)合。3.HALWP4體外抗腫瘤活性:①采用集落形成實(shí)驗(yàn)對(duì)HALWP4的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了研究:使用4.0 mg/mL的不同種多糖處理小鼠肺癌LLC細(xì)胞,同空白組相比給藥組的集落形成的數(shù)目顯著的減少,空白組細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè),HALWP4-1給藥組的抑制集落形成率為52.17±0.75%,HALWP4-2給藥組的集落形成抑制率為56.52土1.23%,HALWP4-3給藥組的集落形成抑制率為65.21 ± 0.98%,HALWP4-4給藥組的集落形成抑制率為69.56±1.34%,n=3,P0.05。②通過(guò)MTT法對(duì)HALWP4中抑制腫瘤集落形成最強(qiáng)的HALWP4-4進(jìn)行體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力進(jìn)行評(píng)估:4.0 mg/mL的HALWP4-4對(duì)人類胃癌細(xì)胞SGC-7901、人類肝癌細(xì)胞L-02以及人類口腔上皮癌細(xì)胞KB的IC50值分別為3.978±0.079 mg/mL、4.871±0.044 mg/mL、6.871±0.079 mg/mL,n=3,P0.05。結(jié)果表明 HALWP4-4 體外抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力較弱,不足以解釋向日葵莖芯的水提液在臨床上具有較強(qiáng)抗癌活性。4.向日葵莖芯多糖體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性:①采用Transwell趨化小室測(cè)定向日葵莖芯多糖抑制腫瘤細(xì)胞遷移的研究:空白組中細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)為320個(gè),4.0 mg/mL的向日葵莖芯多糖(HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3和HALWP4-4)均具有抑制小鼠肺癌細(xì)胞LLC遷移的作用,四個(gè)給藥組細(xì)胞遷移率分別為 90.63±0.49%、75.00±1.32%、40.63±1.07%、25.00±0.99%,n=3,P0.05。其中HALWP4-4的抑制腫瘤細(xì)胞遷移效果最為顯著。②采用劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定向日葵莖芯多糖抑制腫瘤細(xì)胞遷移的研究:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,空白組、4.0 mg/mL的向日葵莖芯多糖(HALWP4-1組、HALWP4-2組、HALWP4-3組和HALWP4-4 組)的愈合率分別為 23.05±0.58%、17.25±1.97%、13.86土0.98%、9.07 ±2.03%、6.90±0.51%,n=3,P0.05。向日葵莖芯多糖四個(gè)組分(HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3和HALWP4-4)均具有抑制小鼠肺癌細(xì)胞LLC轉(zhuǎn)移的能力,且HALWP4-4組抑制小鼠肺癌細(xì)胞LLC轉(zhuǎn)移的能力最強(qiáng)。5.向日葵莖芯多糖抗腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制:①通過(guò)測(cè)定抑制小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7釋放NO含量模型研究向日葵莖芯多糖抗炎能力。4.0 mg/mL HALWP4-1 組,4.0 mg/mL HALWP4-2 組,4.0 mg/mL HALWP4-3 組以及 4.0 mg/mL HALWP4-4 組其 NO 含量分別為,11.35±0.21 μmoL/gprot、7.89 ±0.39 μmoL/gprot、7.69±0.17 μmoL/gprot、7.57±0.18 μmoL/gprot,n=3,P0.05。其NO含量均隨著藥物濃度的升高而降低,因此向四組日葵莖芯多糖(HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3和HALWP4-4)均具有抗炎活性,且HALWP4-4組效果最強(qiáng)。②采用ELISA試劑盒檢測(cè)向日葵莖芯多糖不同組分對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7分泌TNF-α 的量的影響�？瞻捉M、4.0 mg/mL 的 HALWP4-1 組、HALWP4-2 組、HALWP4-3組和 HALWP4-4 組的 TNF-α 的濃度分別為 179.26±10.52 pg/mL、166.70±9.78 pg/mL、175.06±10.65 pg/mL、173.51±9.33 pg/mL 和 1.68.24±9.82 pg/mL。綜上所述,向日葵莖芯多糖具有抗腫瘤及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的活性。另外,向日葵莖芯多糖具有抗炎作用,且抑制小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α的釋放。因此結(jié)合向日葵莖芯多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)推測(cè)向日葵莖芯多糖抗肺癌轉(zhuǎn)移作用機(jī)制是:水溶性的向日葵莖芯多糖通過(guò)其長(zhǎng)鏈脂肪酸與肺癌腫瘤微環(huán)境的巨噬細(xì)胞的Toll 2受體(TLR2)附近的細(xì)胞膜結(jié)合,干擾了肺癌腫瘤細(xì)胞釋放的多功能糖蛋白與巨噬細(xì)胞的Toll 2受體(TLR2)結(jié)合從而減少了巨噬細(xì)胞釋放TNF-α,最終抑制肺癌轉(zhuǎn)移。本研究為向日葵莖芯多糖開(kāi)發(fā)為高效低毒的抗腫瘤藥物打下了堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。
【圖文】：

逑２．７．２邋ＤＥ－５２離子交換柱層析法分離多糖逡逑如圖２－２所示，通過(guò)ＤＥＡＥ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ邋ＤＥ－５２層析柱得到四個(gè)粗多糖組分，采用苯逡逑酚－硫酸法，波長(zhǎng)為４９０邋ｎｍ處測(cè)定其０Ｄ值，洗脫曲線如圖２－２所示，通過(guò)０．１邋Ｍ、０．２逡逑Ｍ、０．３邋Ｍ和０．４邋Ｍ的ＮａＣｌ溶液洗脫后各自出現(xiàn)一個(gè)洗脫峰。將洗脫后得到的各產(chǎn)物逡逑濃縮到適當(dāng)體積后，透析３６邋ｈ純化。ＨＡＬＷＰ－１占多糖的３．０３％、ＨＡＬＷＰ－２占多糖的逡逑４．１９°／。、ＨＡＬＷＰ－３邋占多糖的邋１．８２％，ＨＡＬＷＰ－４邋占多糖的邋０．９６°／0。逡逑１．0１逡逑ＩＩ邋°－８；邋Ａ逡逑ＩＩ邋０．６－邋ｍ邋ｐ邋ｆ＼逡逑ｉｉ０Ａ：［＼邋ｌ）邋ｒ逡逑＜邋°－２－Ｊ邋ｉ！邋［邋Ｊ邋＼邋ｉ＼逡逑Ｑ．Ｏｆ邐■■逡逑０邐２０邐４０邐６０邐８０逡逑管數(shù)逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋ｔｕｂｅｓ逡逑圖２－２向日葵

逑２．７．２邋ＤＥ－５２離子交換柱層析法分離多糖逡逑如圖２－２所示，通過(guò)ＤＥＡＥ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ邋ＤＥ－５２層析柱得到四個(gè)粗多糖組分，采用苯逡逑酚－硫酸法，波長(zhǎng)為４９０邋ｎｍ處測(cè)定其０Ｄ值，洗脫曲線如圖２－２所示，，通過(guò)０．１邋Ｍ、０．２逡逑Ｍ、０．３邋Ｍ和０．４邋Ｍ的ＮａＣｌ溶液洗脫后各自出現(xiàn)一個(gè)洗脫峰。將洗脫后得到的各產(chǎn)物逡逑濃縮到適當(dāng)體積后，透析３６邋ｈ純化。ＨＡＬＷＰ－１占多糖的３．０３％、ＨＡＬＷＰ－２占多糖的逡逑４．１９°／。、ＨＡＬＷＰ－３邋占多糖的邋１．８２％，ＨＡＬＷＰ－４邋占多糖的邋０．９６°／0。逡逑１．0１逡逑ＩＩ邋°－８；邋Ａ逡逑ＩＩ邋０．６－邋ｍ邋ｐ邋ｆ＼逡逑ｉｉ０Ａ：［＼邋ｌ）邋ｒ逡逑＜邋°－２－Ｊ邋ｉ！邋［邋Ｊ邋＼邋ｉ＼逡逑Ｑ．Ｏｆ邐■■逡逑０邐２０邐４０邐６０邐８０逡逑管數(shù)逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋ｔｕｂｅｓ逡逑圖２－２向日葵
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R284;R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2642844