【摘要】：黃連是我國傳統(tǒng)名貴中藥材之一,是毛茛科植物黃連、三角葉黃連、云南黃連的干燥根莖。黃連性寒,味苦,具有清熱燥濕,瀉火解毒的功效,具有歷史悠久,來源和藥用價值廣泛的特點。近年來,隨著中醫(yī)藥與醫(yī)學技術的發(fā)展,黃連越來越多的藥理作用被展示出來了。研究證明,黃連具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌、抗氧化、降血壓、降血脂、降血糖、抗血小板聚集和改善心腦血管疾病等藥理活性。黃連含多種異喹啉類生物堿,主要由小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿、非洲防己堿和藥根堿組成,其中小檗堿含量最多。目前,小檗堿作為廣泛的研究對象,已有許多藥理功效被發(fā)現(xiàn),但其他生物堿還需要深入研究,而黃連堿和小檗堿有相同的母體結構,且兩者結構差異小。肝細胞癌是世界上最常見和最具有侵襲性的惡性腫瘤之一,而其分子發(fā)生機制尚不明確。許多研究表明miR-122是一種肝特異性microRNA,占約肝臟總microRNA的70%,是一種抑癌基因,通常在肝癌中表達下調。因此,本研究建立荷人肝癌細胞株HepG2的BALB/c雄性裸鼠移植瘤模型,初步研究黃連堿的抗肝癌活性及其作用機制;并研究了黃連堿對內毒素和D-氨基半乳糖造成的急性肝損傷的肝預防保護作用。本研究的內容和結構如下:⑴黃連堿安全性。對處于對數期生長狀況良好的HepG2、Huh7和L02細胞進行MTT實驗,檢測不同濃度的黃連堿對細胞毒性的影響,實驗結果顯示黃連堿具有選擇性誘導HepG2、Huh7細胞凋亡而對正常細胞無細胞毒性。當藥物濃度達到25μg/mL時,HepG2和Huh7細胞成活率低于80%,但對L02細胞沒有明顯毒性,但當藥物濃度達到300μg/mL時,L02細胞的成活率低于80%。所以,黃連堿是一種低毒的安全化合物且具有肝保護作用。HepG2、Huh7和L02細胞IC_(50)值分別為47.056μg/mL、61.831μg/mL和329.265μg/mL。⑵黃連堿抗肝癌活性體外實驗:在細胞實驗方面,主要檢測黃連堿對HepG2和Huh7細胞增殖能力、遷徙能力的抑制,對凋亡和miR-122表達的影響。分別通過MTT法和集落形成實驗,劃痕愈合實驗,Hoechst 33258和流式細胞術,RT-qPCR檢測相關指標。實驗結果顯示,HepG2細胞24h的黃連堿IC_(50)值為47.056μg/mL,Huh7細胞的黃連堿IC_(50)值為61.831μg/mL,黃連堿對HepG2的增殖抑制效果更強;并且,25μg/mL濃度的黃連堿在7d后完全抑制HepG2細胞的增殖并且致全部細胞死亡。25μg/mL的黃連堿有效的抑制HepG2、Huh7細胞和轉染miR-122模擬物的HepG2細胞的遷移。黃連堿可誘導肝癌細胞的凋亡。⑶黃連堿抗肝癌活性體內實驗:將處于對數生長期且具有95%存活率的人HepG2細胞,皮下接瘤于4周齡的BALB/c雄性裸鼠的右肩胛部位。實驗隨機分為空白對照組、模型組、陽性藥物組(索拉菲尼,120.13mg/kg)以及黃連堿高劑量組(150mg/kg)。接種后裸鼠隨機分組,每組8只,裸鼠的腫瘤體積每5天測量一次,為期30天。索拉菲尼和黃連堿溶于超純水,藥物組成瘤后每只每日一次按體重進行成灌胃,模型組灌等體積的生理鹽水。通過HE染色分析裸鼠肝臟和腫瘤的組織病理學變化,Western blot和RT-qPCR分別檢測肝臟和腫瘤的相關蛋白的表達變化、miR-122表達水平的變化,并且監(jiān)測裸鼠的腫瘤體積的變化,體重變化,肝、腎、脾與體重重量的變化。實驗結果表明,與模型組相比,黃連堿組與索拉菲尼組均能抑制腫瘤的生長(P0.01)并且兩者之間差異沒有達到顯著性。黃連堿提高了裸鼠肝臟miR-122的表達水平。無論從肉眼直接觀察還是從HE染色結果,均顯示了黃連堿有保護肝臟的效果;臟體比進一步展示出黃連堿的低毒害功效。⑷黃連堿肝保護作用體外實驗:通過MTT法篩選出合適的內毒素(LPS)濃度、黃連堿濃度以及兩者共作用的濃度在HepG2、L02細胞進行后續(xù)實驗以及建立肝損傷細胞模型。以及觀測內毒素和黃連堿對HepG2、L02細胞72h生存率的影響。并通過PT-qPCR檢測了miR-122的變化。通過流式細胞術檢測了轉染miR-122模擬物和miR-122抑制物及其相關對照物后的HepG2、L02細胞的凋亡率的變化。用蛋白免疫印跡法檢測HepG2、L02細胞中相關凋亡蛋白的表達的。實驗結果表明當內毒素達到10μg/mL即可建立細胞的肝損傷模型。黃連堿對肝細胞具有選擇性的保護作用,對HepG2細胞毒性大,但對L02細胞毒性小。黃連堿使HepG2細胞miR-122的表達下調,使L02細胞miR-122的表達上調。黃連堿促進HepG2細胞凋亡,相反,通過抑制凋亡來保護L02細胞。⑸黃連堿肝保護作用體內實驗:4周齡的雄性昆明小鼠隨機分為空白對照組,模型組,黃連堿低劑量組(37.5mg/kg),黃連堿高劑量組(150mg/kg),每組10只小鼠。藥物組進行每只每日一次進行灌胃,連續(xù)7天,最后一次灌胃1h后用內毒素(500ug/kg)/D氨基半乳糖(400mg/kg)混合液進行腹腔注射誘導急性肝損傷模型。檢測血清的AST、ALT,肝組織勻漿的GSH、SOD變化。RT-qPCR檢測肝組織的miR-122變化。HE染色分析肝臟的形態(tài)結構變化,免疫組化分析相關凋亡蛋白的變化。實驗結果顯示,內毒素和D氨基半乳糖導致了肝臟的凋亡,但黃連堿有著上調GSH、SOD、miR-122和下調AST、ALT的能力,黃連堿在急性肝損傷實驗中有預防保護作用。總之,通過上述實驗,表明黃連堿對肝癌細胞有抑制增殖、遷移和促進凋亡的作用,并且在裸鼠中通過上調miR-122來抑制腫瘤的生長和在急性肝損傷中保護肝臟作用。
【圖文】：

第 3 章 黃連堿的安全性評價選擇性誘導 HepG2、Huh7 細胞凋亡而對正常細胞無細胞毒性。當藥物濃度達到 25 μg，HepG2 和 Huh7 細胞成活率低于 80%，但對 L02 細胞沒有明顯毒性（圖 3-1），物濃度達到 300 μg/mL（圖 3-2）時，L02 細胞的成活率低于 80%。所以，黃連堿是毒的安全化合物且具有肝保護作用。HepG2、Huh7 和 L02 細胞 IC50值分別為 47/mL、61.831μg/mL 和 329.265μg/mL。

圖 3-2 黃連堿對 L02 細胞存活率的影響Figure3-2 Effects of Coptisine on L02 cellsviability cells treated with COP at concentrations range from 0 to 500 μg/mL for 24h. The data were shown asD with relative optical density values at 490 nm or counted using a hemocytometer in three dueriments. (*p < 0.05 and**p < 0.01 vs controlgroup).5 討論與小結植物提取物通常因為有著微小的副作用而被認為是安全無害的[87]。臨床上黃連常不良反應主要集中在消化系統(tǒng)（如腹瀉），常規(guī)應用黃連飲片而引起不良反應的情，，不良反應常與個體的體制，既往病史，過敏史，服用藥物的劑量與方式等因素有黃連注射液可引起過敏性休克，黃連忌與菊花等性寒之物配伍，脾胃虛弱的人也不連，黃連也不得長時間服用[88,89]。本研究中，細胞的安全用量通過 MTT 法來選擇
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2641240