發(fā)布時間：2020-04-25 04:20

【摘要】：骨質(zhì)疏松癥(OP)是一種以骨量減少、骨質(zhì)量降低及骨微結(jié)構(gòu)損壞為特征的系統(tǒng)代謝性疾病。根據(jù)發(fā)病原因?qū)⑵浞譃槿箢?第一類為因隨著年齡增長必然發(fā)生的原發(fā)性骨質(zhì)疏松,包括老年性骨質(zhì)疏松和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP);第二類為因某些疾病或者藥物誘導(dǎo)引起的骨質(zhì)疏松,即繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥;第三類為因遺傳因素或妊娠、哺乳期引起的骨質(zhì)疏松,即特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。其中,以絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥最為常見,其主要的發(fā)病機(jī)制是雌激素缺乏、減少后,骨代謝轉(zhuǎn)換亢進(jìn),骨吸收超過骨形成從而導(dǎo)致骨量減少。近年來人口老齡化日益嚴(yán)重,骨質(zhì)疏松患者也越來越多,無論是對個人還是對社會都造成了不可估計的損失,現(xiàn)階段用于防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的藥物多為雌激素替代藥,臨床研究表明此類藥物長期服用可誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌、血管栓塞等疾病,不適合患者長期使用。然而,隨著技術(shù)的不斷發(fā)展及科學(xué)研究的不斷深入,植物雌激素類藥物常用于防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥,本課題組前期已用大量實(shí)驗(yàn)證明補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、五味子甲/乙素等植物雌激素類藥物可以促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞(OB)的增殖及分化,在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘芯肯愣顾仡愔参锎萍に胤鹗指虄?nèi)酯對成骨細(xì)胞生物活性的影響及BGS3促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及提高ALP活性的機(jī)制,為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的治療提供有效的靶點(diǎn)及理論依據(jù)。第一部分:佛手柑內(nèi)酯對大鼠成骨細(xì)胞生物活性的影響目的:探索佛手柑內(nèi)酯對大鼠成骨細(xì)胞生物活性的影響。方法:1大鼠成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察;2噻唑藍(lán)比色法(MTT法)測定不同濃度的佛手柑內(nèi)酯處理細(xì)胞24、48和72 h后大鼠成骨細(xì)胞的增殖;3微量酶標(biāo)法測定不同濃度佛手柑內(nèi)酯處理細(xì)胞48和72 h后堿性磷酸酶(ALP)的活性;4酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定不同濃度佛手柑內(nèi)酯處理細(xì)胞48和72 h后大鼠成骨細(xì)胞骨鈣素(BGP)的含量;5定量PCR測定不同濃度佛手柑內(nèi)酯處理細(xì)胞48和72 h后大鼠成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原(collagenⅠ)mRNA的表達(dá)量。結(jié)果:1大鼠成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定倒置顯微鏡下觀察:細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中24 h后,大部分細(xì)胞貼壁,細(xì)胞貼壁初期形狀多樣,呈多邊形、梭形、長條形,有1~2個核仁,細(xì)胞核大且輪廓清晰,36、48和72 h后,可見細(xì)胞密度逐漸增大,由長條形漸變?yōu)槁褕A形,且細(xì)胞間的邊界逐漸小時至融合成片。ALP染色后可見大部分區(qū)域呈紫色,顏色淺深不同,其染色陽性率為92%。2增殖實(shí)驗(yàn)與對照組比較,不同濃度佛手柑內(nèi)酯作用于成骨細(xì)胞24、48和72 h后,均表現(xiàn)為佛手柑內(nèi)酯濃度為1.0×10~-99 mol/L時,可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖(P0.05),其中48和72 h時促增殖作用最為顯著(P0.01)。3佛手柑內(nèi)酯對大鼠成骨細(xì)胞ALP活性的影響與對照組比較,不同濃度的佛手柑內(nèi)酯作用于細(xì)胞48 h后,0.3×10~(-8)mol/L,1.0×10~-99 mol/L和0.3×10~-99 mol/L濃度的佛手柑內(nèi)酯對成骨細(xì)胞ALP的活性均有顯著的增強(qiáng)作用(P0.001),作用72 h后,1.0×10~-99 mol/L和0.3×10~-99 mol/L濃度的佛手柑內(nèi)酯均增強(qiáng)了ALP的活性,且增強(qiáng)作用很明顯(P0.001)。4佛手柑內(nèi)酯對大鼠成骨細(xì)胞骨鈣素含量的影響與對照組相比,不同濃度的佛手柑內(nèi)酯作用于細(xì)胞48 h后,0.3×10~(-9)mol/L、0.3×10~-88 mol/L濃度的佛手柑內(nèi)酯可明顯的促進(jìn)成骨細(xì)胞骨鈣素分泌,0.3×10~-88 mol/L組最為顯著(P0.001);而給藥處理72 h后,1.0×10~(-8)mol/L的佛手柑內(nèi)酯對成骨細(xì)胞骨鈣素的分泌有明顯的促進(jìn)作用(P0.001)。5佛手柑內(nèi)酯對大鼠成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的影響與對照組比較,不同濃度的佛手柑內(nèi)酯分別作用于大鼠成骨細(xì)胞48和72 h后,由統(tǒng)計結(jié)果看出,48 h時,0.3×10~-88 mol/L的佛手柑內(nèi)酯對Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用(P0.001);72 h時,0.3×10~-99 mol/L的佛手柑內(nèi)酯對Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用(P0.001)。結(jié)論:1一定濃度佛手柑內(nèi)酯可促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖。2佛手柑內(nèi)酯可提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性、促進(jìn)骨鈣素及Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá),從而促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的分化。第二部分:BGS3對大鼠成骨細(xì)胞增殖和ALP活性影響的信號通路研究目的:研究BGS3促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖及提高ALP的活性是否與ERK通路有關(guān)。方法:1大鼠成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察。2噻唑藍(lán)比色法(MTT法)測定藥物處理24、48和72 h后大鼠成骨細(xì)胞的生長情況。3微量酶標(biāo)法測定大鼠成骨細(xì)胞在藥物處理48和72 h后堿性磷酸酶(ALP)的活性。4定量PCR測定成骨細(xì)胞在藥物處理48和72 h后,ALP mRNA表達(dá)情況。結(jié)果:1大鼠成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定鑒定結(jié)果同第一部分2增殖實(shí)驗(yàn)對大鼠成骨細(xì)胞給藥處理24 h時,E_2組與PD+E_2組、BGS3組與PD+BGS3組對比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);48 h數(shù)據(jù)表明,與空白組比較,E_2和BGS3組均可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,E_2組更加明顯(P0.01),E_2組與PD98059+E_2組(P0.001)、BGS3組與PD98059+BGS3組比較(P0.01),ERK通路抑制劑PD98059均可明顯抑制雌二醇(E_2)和BGS3對大鼠成骨細(xì)胞的促增殖作用;72 h的數(shù)據(jù)同樣表明與空白組比較,E_2和BGS3組均可明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,BGS3組最為顯著(P0.001),E_2組與PD98059+E_2組、BGS3組與PD98059+BGS3組比較,ERK通路抑制劑PD98059均可明顯抑制雌二醇(E_2)和BGS3對大鼠成骨細(xì)胞的促增殖作用(P0.001)。3基于ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,BGS3對成骨細(xì)胞ALP活性的影響按照分組對成骨細(xì)胞進(jìn)行藥物處理,48 h時,與空白組比較,E_2和BGS3組均可增強(qiáng)成骨細(xì)胞ALP的活性(P0.001),E_2組與PD98059+E_2組、BGS3組與PD98059+BGS3組比較,ERK通路抑制劑PD98059均可明顯抑制雌二醇(E_2)和BGS3對大鼠成骨細(xì)胞ALP活性的增強(qiáng)作用(P0.001);在72 h時同樣發(fā)現(xiàn),與空白組比較,E_2和BGS3組均可增強(qiáng)成骨細(xì)胞ALP的活性(P0.001),E_2組與PD98059+E_2組、BGS3組與PD98059+BGS3組比較,ERK通路抑制劑PD98059均可明顯抑制雌二醇(E_2)和BGS3對大鼠成骨細(xì)胞ALP活性的增強(qiáng)作用(P0.001)。4基于ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,BGS3對成骨細(xì)胞ALP mRNA表達(dá)的影響給藥處理48 h時,與空白組比較,E_2和BGS3組均可促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP mRNA的表達(dá),E_2組最為顯著(P0.01),E_2組與PD98059+E_2組、BGS3組與PD98059+BGS3組比較,ERK通路抑制劑PD98059均可顯著抑制雌二醇(E_2)和BGS3對大鼠成骨細(xì)胞ALP mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用(P0.001);在72 h時同樣發(fā)現(xiàn),與空白組比較,E_2和BGS3組均可促進(jìn)成骨細(xì)胞ALPmRNA的表達(dá)(P0.05),E_2組與PD98059+E_2組(P0.05)、BGS3組與PD98059+BGS3組(P0.01)比較,ERK通路抑制劑PD98059均可明顯抑制雌二醇(E_2)和BGS3對大鼠成骨細(xì)胞ALP mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用。結(jié)論:1 BGS3經(jīng)ERK信號通路促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖。2 BGS3經(jīng)ERK信號通路增強(qiáng)大鼠成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性及ALP mRNA的表達(dá)。
【圖文】：

24圖 1-6 佛手柑內(nèi)酯作用 24、48 和 72 h 對細(xì)胞增殖的影響 Effect of Bergapten on the proliferation of osteoblasts in 24, 48 andh*P<0.05, **P<0.01 , ***P<0.001 compared with the control group

25圖1-7 佛手柑內(nèi)酯作用48 和72 h對成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響Fig.1-7 Effect of Bergapten on theALP activity of osteoblasts in 48 and 72h***P<0.001 compared with the control group圖 1-8 佛手柑內(nèi)酯作用 48 和 72 h 對成骨細(xì)胞骨鈣素的影響Fig.1-8 Effect of Bergapten on the BGP level of osteoblasts in 48 and 72h**P<0.01, ***P<0.001 compared with the control group
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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4 趙艷威;李宗e，

本文編號：2639797