【摘要】：黑色素瘤是由黑色素細(xì)胞過度增殖引發(fā)的皮膚腫瘤,惡性程度比較高,易轉(zhuǎn)移,預(yù)后差且死亡率比較高。目前主要的臨床治療手段有:手術(shù)、化療、免疫療法和靶向治療,但治療效果仍然不理想。所以其發(fā)病率也是近年來增長(zhǎng)較快的惡性腫瘤之一。目前已經(jīng)上市的治療黑色素瘤的藥物有威羅菲尼、達(dá)拉菲尼、曲美替尼、替莫唑胺、白細(xì)胞介素-2等。絞股藍(lán)是一種多年生的草質(zhì)藤本植物,主要活性物質(zhì)為絞股藍(lán)皂苷,目前已知的功效有抗炎、保肝、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤作用,此外還具有降低血脂、防治心腦血管疾病及免疫調(diào)節(jié)的作用。Gypenoside LI是一種絞股藍(lán)皂苷單體,其藥理作用尚未見報(bào)道。盡管研究表明絞股藍(lán)總皂苷具有抗腫瘤的功能,但是目前還沒有研究報(bào)道絞股藍(lán)皂苷單體gypenoside LI誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡。因此,探究gypenoside LI對(duì)黑色素瘤的作用尤為重要。miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼RNA,長(zhǎng)度為18-24bp,其作用機(jī)制是與靶基因的3'-UTR結(jié)合,降低靶基因mRNA的穩(wěn)定性,抑制靶蛋白的合成,從而在細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和凋亡中起重要作用。大量數(shù)據(jù)表明miRNA在眾多腫瘤中都存在異常表達(dá),而這一發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用于臨床診斷和治療。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-128-3p在肺癌、肝癌、淋巴性白血病等癌癥中有異常表達(dá),而在黑色素瘤中是否存在這一現(xiàn)象并未見報(bào)道。因此,本課題將探究miR-128-3p對(duì)黑色素瘤增殖的影響及其調(diào)控機(jī)制。研究目的:探究gypenoside LI對(duì)A375和SK-MEL-28黑色素瘤細(xì)胞系的抑制作用;研究gypenoside LI是否通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制A375和SK-MEL-28細(xì)胞的增殖;探討黑色素瘤細(xì)胞中miR-128-3p的表達(dá)情況;研究miR-128-3p對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響;探討miR-128-3p影響黑色素瘤細(xì)胞增殖作用的分子機(jī)制。方法1:cck-8檢測(cè)gypenoside LI和Cisplatin對(duì)HaCat、A375和SK-MEL-28細(xì)胞的毒性作用;Gypenoside LI在IC_(50)藥物濃度下作用于黑色素瘤細(xì)胞系24 h的形態(tài)學(xué)觀察;AV/PI凋亡檢測(cè)gypenoside LI誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的凋亡情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)gypenoside LI對(duì)A375、SK-MEL-28周期的影響;細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)檢測(cè)gypenoside LI對(duì)A375、SK-MEL-28單個(gè)細(xì)胞的增殖能力;Western blot檢測(cè)gypenoside LI對(duì)凋亡相關(guān)蛋白(PARP、Caspase 9、BID、FLIP、Bcl-2),周期相關(guān)蛋白(CDK2、p-CDK2),Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白(β-catenin、DVl-2、Cyclin D1)及細(xì)胞因子IL-24蛋白表達(dá)的影響。方法2:qPCR檢測(cè)miR-128-3p在人正常永生化表皮細(xì)胞HaCat和黑色素瘤A375細(xì)胞中的表達(dá)情況;cck-8檢測(cè)miR-128-3p對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響;miR-128-3p對(duì)HaCat、A375細(xì)胞集落和遷移(Transwell實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn))的影響;TargetScan軟件預(yù)測(cè)miR-128-3p的靶基因;轉(zhuǎn)染miR-128-3p后,Western blot檢測(cè)HaCat和A375細(xì)胞靶蛋白的表達(dá)情況及與細(xì)胞增殖等相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果1:cck-8檢測(cè)gypenoside LI作用于A375細(xì)胞的IC_(50)為75μg/mL,SK-MEL-28細(xì)胞的IC_(50)為29.71μg/mL;細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察給藥處理24 h后細(xì)胞凋亡成時(shí)間依賴性發(fā)生;流式細(xì)胞儀檢測(cè)A375細(xì)胞中處理組早期凋亡率為45.3%,對(duì)照組為6.5%,早期凋亡率遠(yuǎn)高于未處理組;流式細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明gypenoside LI將A375、SK-MEL-28細(xì)胞阻滯在S期;同時(shí),細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)表明gypenoside LI能夠抑制黑色素瘤單個(gè)細(xì)胞的增殖能力;Western blot結(jié)果顯示,給藥處理組凋亡蛋白PARP、Caspase 9、BID的剪切條帶表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加,FLIP、Bcl-2較對(duì)照組表達(dá)量減少;處理組的周期相關(guān)蛋白CDK2、p-CDK2與對(duì)照組相比表達(dá)量明顯減少;Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、DVl-2、Cyclin D1的蛋白表達(dá)量也減少;而IL-24蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比增多。結(jié)果2:qPCR檢測(cè)結(jié)果為miR-128-3p在HaCat細(xì)胞中高表達(dá),而在黑色素瘤A375細(xì)胞中低表達(dá);cck-8數(shù)據(jù)顯示過表達(dá)miR-128-3p模擬物后可抑制A375細(xì)胞的增殖;轉(zhuǎn)染miR-128-3p inhibitor后,HaCat細(xì)胞與對(duì)照組相比細(xì)胞集落數(shù)目成濃度梯度增多,細(xì)胞遷移率(Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn))成濃度梯度增大;過表達(dá)miR-128-3p后,A375細(xì)胞與對(duì)照組相比集落數(shù)目成濃度梯度減少,細(xì)胞遷移率(Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn))也成濃度梯度減小;而與細(xì)胞遷移有關(guān)的蛋白MMP2、MMP9表達(dá)量在下調(diào)miR-128-3p的正常株HaCat細(xì)胞中表達(dá)增多,而在過表達(dá)miR-128-3p的黑色素瘤A375細(xì)胞株中表達(dá)量減少;TargetScan軟件預(yù)測(cè)到與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因DVL2和CDC6為miR-128-3p的靶基因;下調(diào)miR-128-3p后,Western blot結(jié)果顯示HaCat細(xì)胞中DVl-2、Cdc6蛋白高表達(dá),而過表達(dá)miR-128-3p后的A375細(xì)胞中DVl-2、Cdc6蛋白表達(dá)量減少;與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)的β-catenin蛋白在下調(diào)miR-128-3p的HaCat細(xì)胞中表達(dá)量增多,而在過表達(dá)miR-128-3p的A375細(xì)胞中表達(dá)量減少;與周期相關(guān)的CDK2在轉(zhuǎn)染miR-128-3p inhibitor的HaCat細(xì)胞中表達(dá)增多,相反,在過表達(dá)miR-128-3p的A375細(xì)胞中表達(dá)減少。結(jié)論:1.Gypenoside LI可以通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路來抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖,它可以將細(xì)胞阻滯在S期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2.miR-128-3p通過調(diào)控DVL2、CDC6基因的表達(dá)抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Bing Hu;Shuang-Shuang Wang;Qin Du;;Traditional Chinese medicine for prevention and treatment of hepatocarcinoma: From bench to bedside[J];World Journal of Hepatology;2015年09期

2 Qin He;Jin-Ke Li;Fang Li;Ru-Gui Li;Guo-Qing Zhan;Gang Li;Wei-Xing Du;Hua-Bing Tan;;Mechanism of action of gypenosides on type 2 diabetes and non-alcoholic fatty liver disease in rats[J];World Journal of Gastroenterology;2015年07期

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本文編號(hào)：2637699