【摘要】：黑色素瘤是由黑色素細胞過度增殖引發(fā)的皮膚腫瘤,惡性程度比較高,易轉(zhuǎn)移,預(yù)后差且死亡率比較高。目前主要的臨床治療手段有:手術(shù)、化療、免疫療法和靶向治療,但治療效果仍然不理想。所以其發(fā)病率也是近年來增長較快的惡性腫瘤之一。目前已經(jīng)上市的治療黑色素瘤的藥物有威羅菲尼、達拉菲尼、曲美替尼、替莫唑胺、白細胞介素-2等。絞股藍是一種多年生的草質(zhì)藤本植物,主要活性物質(zhì)為絞股藍皂苷,目前已知的功效有抗炎、保肝、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤作用,此外還具有降低血脂、防治心腦血管疾病及免疫調(diào)節(jié)的作用。Gypenoside LI是一種絞股藍皂苷單體,其藥理作用尚未見報道。盡管研究表明絞股藍總皂苷具有抗腫瘤的功能,但是目前還沒有研究報道絞股藍皂苷單體gypenoside LI誘導(dǎo)黑色素瘤細胞凋亡。因此,探究gypenoside LI對黑色素瘤的作用尤為重要。miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼RNA,長度為18-24bp,其作用機制是與靶基因的3'-UTR結(jié)合,降低靶基因mRNA的穩(wěn)定性,抑制靶蛋白的合成,從而在細胞增殖、分化、發(fā)育和凋亡中起重要作用。大量數(shù)據(jù)表明miRNA在眾多腫瘤中都存在異常表達,而這一發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用于臨床診斷和治療。有文獻報道m(xù)iR-128-3p在肺癌、肝癌、淋巴性白血病等癌癥中有異常表達,而在黑色素瘤中是否存在這一現(xiàn)象并未見報道。因此,本課題將探究miR-128-3p對黑色素瘤增殖的影響及其調(diào)控機制。研究目的:探究gypenoside LI對A375和SK-MEL-28黑色素瘤細胞系的抑制作用;研究gypenoside LI是否通過Wnt/β-catenin信號通路抑制A375和SK-MEL-28細胞的增殖;探討黑色素瘤細胞中miR-128-3p的表達情況;研究miR-128-3p對黑色素瘤細胞增殖的影響;探討miR-128-3p影響黑色素瘤細胞增殖作用的分子機制。方法1:cck-8檢測gypenoside LI和Cisplatin對HaCat、A375和SK-MEL-28細胞的毒性作用;Gypenoside LI在IC_(50)藥物濃度下作用于黑色素瘤細胞系24 h的形態(tài)學(xué)觀察;AV/PI凋亡檢測gypenoside LI誘導(dǎo)黑色素瘤細胞的凋亡情況;流式細胞術(shù)檢測gypenoside LI對A375、SK-MEL-28周期的影響;細胞集落實驗檢測gypenoside LI對A375、SK-MEL-28單個細胞的增殖能力;Western blot檢測gypenoside LI對凋亡相關(guān)蛋白(PARP、Caspase 9、BID、FLIP、Bcl-2),周期相關(guān)蛋白(CDK2、p-CDK2),Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白(β-catenin、DVl-2、Cyclin D1)及細胞因子IL-24蛋白表達的影響。方法2:qPCR檢測miR-128-3p在人正常永生化表皮細胞HaCat和黑色素瘤A375細胞中的表達情況;cck-8檢測miR-128-3p對A375細胞增殖的影響;miR-128-3p對HaCat、A375細胞集落和遷移(Transwell實驗、細胞劃痕實驗)的影響;TargetScan軟件預(yù)測miR-128-3p的靶基因;轉(zhuǎn)染miR-128-3p后,Western blot檢測HaCat和A375細胞靶蛋白的表達情況及與細胞增殖等相關(guān)蛋白的表達情況。結(jié)果1:cck-8檢測gypenoside LI作用于A375細胞的IC_(50)為75μg/mL,SK-MEL-28細胞的IC_(50)為29.71μg/mL;細胞形態(tài)學(xué)觀察給藥處理24 h后細胞凋亡成時間依賴性發(fā)生;流式細胞儀檢測A375細胞中處理組早期凋亡率為45.3%,對照組為6.5%,早期凋亡率遠高于未處理組;流式細胞周期檢測實驗表明gypenoside LI將A375、SK-MEL-28細胞阻滯在S期;同時,細胞集落實驗表明gypenoside LI能夠抑制黑色素瘤單個細胞的增殖能力;Western blot結(jié)果顯示,給藥處理組凋亡蛋白PARP、Caspase 9、BID的剪切條帶表達量較對照組明顯增加,FLIP、Bcl-2較對照組表達量減少;處理組的周期相關(guān)蛋白CDK2、p-CDK2與對照組相比表達量明顯減少;Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、DVl-2、Cyclin D1的蛋白表達量也減少;而IL-24蛋白表達量與對照組相比增多。結(jié)果2:qPCR檢測結(jié)果為miR-128-3p在HaCat細胞中高表達,而在黑色素瘤A375細胞中低表達;cck-8數(shù)據(jù)顯示過表達miR-128-3p模擬物后可抑制A375細胞的增殖;轉(zhuǎn)染miR-128-3p inhibitor后,HaCat細胞與對照組相比細胞集落數(shù)目成濃度梯度增多,細胞遷移率(Transwell、劃痕實驗)成濃度梯度增大;過表達miR-128-3p后,A375細胞與對照組相比集落數(shù)目成濃度梯度減少,細胞遷移率(Transwell、劃痕實驗)也成濃度梯度減小;而與細胞遷移有關(guān)的蛋白MMP2、MMP9表達量在下調(diào)miR-128-3p的正常株HaCat細胞中表達增多,而在過表達miR-128-3p的黑色素瘤A375細胞株中表達量減少;TargetScan軟件預(yù)測到與細胞增殖相關(guān)的基因DVL2和CDC6為miR-128-3p的靶基因;下調(diào)miR-128-3p后,Western blot結(jié)果顯示HaCat細胞中DVl-2、Cdc6蛋白高表達,而過表達miR-128-3p后的A375細胞中DVl-2、Cdc6蛋白表達量減少;與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)的β-catenin蛋白在下調(diào)miR-128-3p的HaCat細胞中表達量增多,而在過表達miR-128-3p的A375細胞中表達量減少;與周期相關(guān)的CDK2在轉(zhuǎn)染miR-128-3p inhibitor的HaCat細胞中表達增多,相反,在過表達miR-128-3p的A375細胞中表達減少。結(jié)論:1.Gypenoside LI可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來抑制黑色素瘤細胞的增殖,它可以將細胞阻滯在S期并誘導(dǎo)細胞凋亡。2.miR-128-3p通過調(diào)控DVL2、CDC6基因的表達抑制黑色素瘤細胞的增殖。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：2637699