【摘要】：研究背景肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝癌微環(huán)境中的主要構(gòu)成細(xì)胞之一,也是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞�；罨腍SC可以異常分泌一些細(xì)胞因子并通過激活ERK和NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲,微環(huán)境中的肝癌細(xì)胞又能夠刺激活化的HSC表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子,促進(jìn)腫瘤的形成。因此,抑制HSC的活化,有利于降低肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),減緩腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移。導(dǎo)師凌昌全自擬的中藥復(fù)方“解毒方”(Jiedu Fang,JDF),在臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中均表現(xiàn)出良好的抗肝癌作用。然而既往的機(jī)制研究多局限于肝癌細(xì)胞本身。鑒于HSC活化在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的重要作用,我們擬以HSC為立足點(diǎn),觀察解毒方是否能夠通過影響HSC的增殖活化進(jìn)而發(fā)揮抗肝癌的作用。研究目的1、解毒方對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用以及相關(guān)分子機(jī)制;2、解毒方對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖、活化的作用及分子機(jī)制;3、肝星狀細(xì)胞和肝癌細(xì)胞之間的相互影響以及解毒方的作用。研究方法1、解毒方浸膏粉的制備由上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司加工,貓人參420 g、石見穿420 g、山慈菇168 g、雞內(nèi)金168 g,得浸膏粉30 g。將解毒方浸膏粉研成細(xì)粉后,200目濾網(wǎng)過濾。然后稱取浸膏粉1 g,加入1 ml DMSO溶解,后加入15 ml無血清DMEM培養(yǎng)基充分溶解,3000 rpm離心15 min,用0.22μM濾器將上清過濾除菌,定容至20 ml,使藥物終濃度為50 mg/ml。2 ml/管分裝凍存于-20℃。2、解毒方對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移的影響采用MTT法、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell觀察解毒方對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、HepG2及大鼠肝癌細(xì)胞RH-35增殖的作用。Western blot檢測(cè)解毒方對(duì)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。3、解毒方對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖、活化的影響分離大鼠原代肝星狀細(xì)胞,采用MTT法檢測(cè)解毒方對(duì)人肝星狀細(xì)胞LX-2及大鼠原代肝星狀細(xì)胞增殖的影響;Western blot法觀察解毒方對(duì)星狀細(xì)胞α-SMA表達(dá)及MAPKs磷酸化的影響。4、肝癌細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞相互的影響及解毒方的作用(1)采用肝癌細(xì)胞smmc-7721條件培養(yǎng)基刺激肝星狀細(xì)胞,并用不同濃度的解毒方進(jìn)行干預(yù),采用免疫熒光及westernblot觀察解毒方對(duì)肝癌細(xì)胞促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化的影響;(2)采用解毒方干預(yù)肝星狀細(xì)胞的活化,并獲取條件培養(yǎng)基,利用肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理肝癌細(xì)胞,通過劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell等方法觀察肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響及解毒方的作用。研究結(jié)果1、解毒方在體外能夠抑制人肝癌細(xì)胞smmc-7721、hepg2及大鼠肝癌細(xì)胞rh-35的增殖,其作用具有時(shí)間和濃度依賴性;2、tgf-β能夠顯著的促進(jìn)smmc-7721劃痕的“愈合”,在12h時(shí)與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),而在24h時(shí),雖然tgf-β組劃痕小于對(duì)照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。而不同濃度的解毒方在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能夠顯著抑制tgf-β誘導(dǎo)的smmc-7721細(xì)胞劃痕的愈合(p0.01),提示解毒方在一定程度上能夠抑制tgf-β誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞遷移。tgf-β刺激能夠顯著增加肝癌細(xì)胞n-cadherin、mmp-2/9表達(dá),而使用不同濃度的解毒方能夠顯著抑制tgf-β誘導(dǎo)的n-cadherin表達(dá),降低mmp-2/9的表達(dá)水平,其作用具有劑量依賴性;3、解毒方在體外能夠抑制人肝星狀細(xì)胞lx-2、大鼠原代肝星狀細(xì)胞的增殖,其作用具有時(shí)間和濃度依賴性;4、westernblot結(jié)果顯示,tgf-β能夠顯著促進(jìn)lx-2及大鼠原代肝星狀細(xì)胞中α-sma的表達(dá)。而采用不同濃度的解毒方預(yù)處理,能夠顯著抑制tgf-β誘導(dǎo)的α-sma表達(dá)。tgf-β刺激能夠顯著上調(diào)lx-2細(xì)胞中erk,p38及jnk的磷酸化水平,而使用不同濃度的jdf預(yù)處理后,erk,p38及jnk的磷酸化水平顯著低于單獨(dú)使用tgf-β刺激組;5、免疫熒光及westernblot結(jié)果顯示,肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠顯著增加大鼠原代肝星狀細(xì)胞中α-sma的表達(dá),而給予不同濃度的jdf預(yù)處理后,α-sma表達(dá)顯著降低。劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell結(jié)果顯示,活化的肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移,而經(jīng)過解毒方預(yù)處理的肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠抑制肝癌細(xì)胞遷移,其作用顯著高于未處理的肝星狀細(xì)胞條件培養(yǎng)基,提示解毒方能夠通過抑制肝星狀細(xì)胞活化,進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的遷移;結(jié)論1、解毒方在體外能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移;2、解毒方能夠抑制肝星狀細(xì)胞的增殖及活化,其作用可能與抑制MAPKs信號(hào)通路磷酸化有關(guān);3、解毒方能夠抑制肝癌細(xì)胞對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的作用;4、解毒方能夠通過抑制肝星狀細(xì)胞活化,進(jìn)一步抑制肝癌細(xì)胞的遷移。
【圖文】：

學(xué)位論文結(jié)果毒方對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響毒方對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響，我們首先采用 MTT 法MC-7721、HepG2 及大鼠肝癌細(xì)胞 RH-35 增殖的影響細(xì)胞株均具有一定的增殖抑制作用，其作用具有時(shí)

1×104/well in 100 μl of complete DMEM medium. After incubated for 24 h, the cells weretreated with indicated concentrations of JDF. After incubated for 24 or 48 h, MTT assaywas performed to determine the proliferation of cell. A, B, C, the effect of JDF onSMMC-7721, HepG2 and RH-35 cells proliferation, respectively. Each bare represents themeans ± S.D. (n=6). *p <0.05, * *p <0.01,vs control group.（二）解毒方對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響然后，我們采用劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell 小室觀察了解毒方對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響。采用 ibidi 劃痕實(shí)驗(yàn)插件，將 SMMC-7721 細(xì)胞鋪于插件兩側(cè)，20,000/孔，24 h 后，取出插件，加入 TGF-β（10 ng/ml）及不同濃度的解毒方（JDF），在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍照（圖 2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β 能夠顯著的促進(jìn) SMMC-7721 劃痕的“愈合”，在 12 h時(shí)與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而在 24 h 時(shí)，雖然 TGF-β 組劃痕小于對(duì)照組，，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而不同濃度的解毒方組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能夠顯著抑制 TGF-β 誘導(dǎo)的 SMMC-7721 細(xì)胞劃痕的愈合（P＜0.01），提示解毒方可能能夠抑制 TGF-β 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞遷移。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2635278