【摘要】：目的:通過建立佐劑關(guān)節(jié)炎和膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型,考察烏頭堿對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用。以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究對(duì)象,考察烏頭堿對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力、細(xì)胞因子及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,以探討其作用機(jī)制。方法:1.烏頭堿對(duì)AA大鼠模型的治療作用。Wistar大鼠50只,按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、甲氨蝶呤組、烏頭堿低、高劑量組。除正常對(duì)照組外,各組大鼠右后足皮內(nèi)注射弗式完全佐劑建立大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型。造模后第10天,烏頭堿低、高劑量組分別灌胃0.025、0.050 mg/kg烏頭堿,1次/d,甲氨蝶呤組灌胃0.5 mg/kg甲氨蝶呤,2次/周,連續(xù)給藥19 d。末次給藥后,使用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠足腫脹度,按5級(jí)評(píng)分法計(jì)算大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù),計(jì)算脾臟、胸腺指數(shù),酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中白介素6(IL-6)、TNF-α水平,采用HE染色觀察大鼠右足踝關(guān)節(jié)部位病理學(xué)改變。2.烏頭堿對(duì)CIA大鼠模型的治療作用。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)的大鼠模型的建立:除正常對(duì)照組外,各組大鼠尾根部注射0.2 mL 1 mg/mL二型膠原乳化劑,并在初次免疫7天后,在大鼠相同部位注射相同體積的膠原乳化劑加強(qiáng)免疫。在初次免疫14天后,將建模后大鼠隨機(jī)分為5組,分別是正常對(duì)照組、模型組、甲氨蝶呤組、烏頭堿低、高劑量組,并分別給予烏頭堿(0.025、0.050 mg/kg)治療后,并考察烏頭堿抗CIA大鼠關(guān)節(jié)炎作用,包括關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI),足趾腫脹度,以及烏頭堿對(duì)CIA大鼠免疫器官指數(shù),血清中IL-6、TNF-α水平和CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理切片的影響。3.烏頭堿抗炎作用機(jī)制。體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞系,分別以0,0.002,0.003,0.005,0.011,0.021,0.042,0.083,0.165,0.330 mg/mL烏頭堿處理24 h,并設(shè)立正常對(duì)照組,采用MTT檢測(cè)烏頭堿對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響;設(shè)立正常對(duì)照組、脂多糖(LPS)組、LPS+烏頭堿(0.083,0.165,0.330 mg/mL)組,ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清IL-6、TNF-α水平及Griess試劑檢測(cè)NO含量,蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)胞核內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果:與正常對(duì)照組比較,AA/CIA模型組大鼠足腫脹度、AI、免疫器官指數(shù)、IL-6和TNF-α水平顯著增高(P0.01,P0.05),AA模型組胸腺指數(shù)明顯降低,烏頭堿可明顯減輕AA/CIA大鼠的足腫脹度(P0.01,P0.05),降低AA/CIA關(guān)節(jié)炎評(píng)分指數(shù)(P0.01,P0.05),降低兩種RA大鼠脾臟指數(shù)(P0.01,P0.05)、CIA胸腺指數(shù)(P0.05)和升高AA胸腺指數(shù)(P0.05);降低RA大鼠血清中IL-6、TNF-α水平(P0.01,P0.05),但是對(duì)AA大鼠血清中TNF-α影響未見明顯變化。此外,烏頭堿能夠明顯改善AA/CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病變情況,并能降低病理評(píng)分(P0.05,P0.01)。MTT結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,烏頭堿各濃度組細(xì)胞均能保持較好的活力,并沒有明顯的細(xì)胞毒性(P0.05),后續(xù)實(shí)驗(yàn)烏頭堿濃度為0.083、0.165及0.330 mg/mL。ELISA結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,LPS模型組IL-6、TNF-α含量明顯高于正常組(P0.01),與LPS模型組相比,烏頭堿各濃度組能夠抑制IL-6、TNF-α的產(chǎn)生(P0.05,P0.01),Western blot結(jié)果顯示,LPS能夠上調(diào)RAW264.7細(xì)胞p-IκBα、核內(nèi)NF-κB p65蛋白水平,而烏頭堿能夠抑制IκBα蛋白磷酸化,抑制NF-κB p65蛋白的入核。結(jié)論:烏頭堿對(duì)AA/CIA大鼠具有一定的治療作用,其作用機(jī)制可能是烏頭堿能夠抑制IKKβ、IκBα的磷酸化,從而抑制NF-κB信號(hào)通路活化。
【圖文】：

堿對(duì) AA 大鼠腫脹度的影響對(duì)照組比較，各組大鼠在造模 10 h 后足跖急速腫脹，18 h 左右達(dá)跖腫脹降低，，12 d 后足跖腫脹程度達(dá)到最低；在此期間，與正各組大鼠右側(cè)足跖腫脹明顯(P<0.01)；而除正常對(duì)照組外，各造跖腫脹度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明造模成功。給藥 7 d 后，烏頭堿低跖腫脹度也有降低趨勢(shì)。給藥 19 d 后，與模型組比較，烏頭堿腫脹度顯著降低，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。烏頭堿高劑所降低，但是不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。如表 3-2。表 3-2AC 對(duì) AA 大鼠腫脹度的影響( ±s,n=10)Table 3-2 Effect of paw volume in AA rats treated with AC( ±s,n=10)AA 大鼠腫脹度(μL)

照組相比##P<0.01；與模型組相比**P<0.01,*P<0.05。堿對(duì) AA 大鼠 AI 的影響在接種弗氏完全佐劑致炎 6 d 后，造模大鼠關(guān)節(jié)紅腫程度明顯比，給藥 9 d 后（致炎后第 18 天），烏頭堿低劑量組可顯著 AI(P<0.05)，給藥 15 d 后（致炎后第 24 天），烏頭堿低、高低關(guān)節(jié)炎大鼠的 AI(P<0.01，P<0.05)。甲氨蝶呤組給藥 15 d 后）對(duì)大鼠 AI 也有顯著降低作用(P<0.05)。如表 3-3。表 3-3AC 對(duì) AA 大鼠關(guān)節(jié)評(píng)分指數(shù)的影響( ±s,n=10)Table 3-3 Effect of arthritis scores in AA rats treated with AC( ±s,n=10劑量（mg/kg）AA 大鼠 AI6 d 12 d 18 d 24 d
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2635139