【摘要】：苦木為苦木科植物苦木Picrasma quassioides(D.Don)Benn.的干燥枝和葉,是一種廣泛分布于中國(guó)南方的落葉植物,具有清熱、解毒、祛濕等療效,為歷版中國(guó)藥典所收載。其中苦木生物堿(Picrasma quassioides alkaloids,PQAs)是主要的功效成分和質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2015版《中國(guó)藥典》中僅對(duì)其性狀、顯微鑒別、薄層鑒別進(jìn)行了規(guī)定,缺少對(duì)定性定量等關(guān)鍵內(nèi)容的研究。文獻(xiàn)研究中質(zhì)量控制方法的適用性差,并且對(duì)功效作用機(jī)制研究不充分。本論文針對(duì)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)研究的缺陷,對(duì)總堿含量測(cè)定、指紋圖譜進(jìn)行研究,并探索苦木生物堿的功效作用機(jī)制,為苦木的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高以及深入開發(fā)利用提供合理的科學(xué)依據(jù)�；谏飰A與改良碘化鉍鉀試液的絡(luò)合沉淀反應(yīng),創(chuàng)新建立一種快速、簡(jiǎn)便的透射比濁定量分析方法,應(yīng)用于苦木藥材總生物堿含量測(cè)定。以苦木藥材中豐度最高的生物堿成分苦木酮為對(duì)照,結(jié)合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究,優(yōu)化反應(yīng)溶劑、介質(zhì)酸度、反應(yīng)時(shí)間等關(guān)鍵反應(yīng)條件,確定在0.1 mol/L鹽酸水溶液中反應(yīng)5~20 min,于500 nm處測(cè)定吸光度值,外標(biāo)法計(jì)算試樣中總生物堿含量。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明,所建立的方法具有良好的線性和準(zhǔn)確度,線性方程為A=5.7654C-0.1444,相關(guān)系數(shù)(Correlation coefficient,r)為0.9984,平均回收率大于90.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation,RSD)小于5.0%,表明透射比濁法滿足定量分析的要求。該方法應(yīng)用于20批不同產(chǎn)地批號(hào)的苦木藥材總生物堿含量測(cè)定,平均含量為5.12 mg/g。為苦木藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了可靠的依據(jù)。建立了以苦木酮為對(duì)照的苦木藥材高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)指紋圖譜,色譜條件采用Agilent 1100高效液相色譜儀,固定相選取的是Phenomenex Gemini C_(18)柱(250×4.6 mm,5μm);柱溫為30℃;流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水體系,梯度洗脫程序?yàn)?~5 min 18%A→20%A,5~14 min20%A→28%A,14~16 min 28%A→35%A,16~40 min 35%A,流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,進(jìn)樣量20μL,記錄40 min色譜圖。該方法縮短了分析時(shí)間,提高了系統(tǒng)穩(wěn)定性和耐用性,改善了峰的分離情況。系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證表明所建立的方法穩(wěn)定可靠,適用于苦木藥材的指紋圖譜測(cè)定。依據(jù)12批樣品圖譜生成對(duì)照?qǐng)D譜,確定了19個(gè)共有峰,其中苦木酮為參比峰,為苦木藥材質(zhì)量控制提供了可靠的對(duì)照指紋圖譜。12批樣品的相似度均大于0.90,所形成的指紋圖譜可有效的反映苦木藥材的整體物質(zhì)組成特征。利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS),鑒定了18種可能存在的苦木生物堿成分,并將結(jié)果與指紋圖譜關(guān)聯(lián),指認(rèn)了其中17個(gè)峰的可能成分。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了苦木生物堿成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò),系統(tǒng)研究了苦木生物堿的作用機(jī)制。共預(yù)測(cè)了包括121個(gè)靶點(diǎn)和91條通路,排名位列前十的通路為介導(dǎo)癌癥、炎癥以及免疫相關(guān)的通路。最終篩選排名位列第一的色氨酸代謝通路,得到了該通路中介導(dǎo)癌癥、炎癥以及免疫相關(guān)的靶點(diǎn)吲哚胺-2,3-雙加氧酶(Indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)。IDO是通過(guò)色氨酸途徑進(jìn)行癌癥免疫治療的重要靶點(diǎn)之一。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬和體外酶動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià),首次從苦木中的天然生物堿中發(fā)現(xiàn)具有潛在IDO抑制活性的化合物。基于分子對(duì)接分析表明,與IDO活性位點(diǎn)上亞鐵離子配位對(duì)抑制效力有很大影響,氫鍵和疏水相互作用也顯示出較大作用。構(gòu)效關(guān)系(Structure-activity relationship,SAR)研究發(fā)現(xiàn)生物堿骨架類型對(duì)結(jié)合能及活性具有關(guān)鍵的影響,具有C-1羧基取代基的β-咔巴啉是這些生物堿的IDO抑制效力的關(guān)鍵藥效團(tuán)。酶促測(cè)定為1-甲酸-β-咔巴啉的有效性提供了進(jìn)一步證據(jù),1-甲酸-β-咔巴啉在這些苦木生物堿中顯示為IDO中最有效的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,抑制常數(shù)(Inhibitory constant,K_i)和半抑制濃度(50%inhibiting concentration,IC_(50))分別為9.4μmol/L和32μmol/L。因此,這種天然色氨酸衍生的生物堿作為癌癥免疫療法有前景的IDO調(diào)節(jié)劑值得進(jìn)一步深入研究。綜上所述,本課題通過(guò)對(duì)苦木質(zhì)量控制的關(guān)鍵內(nèi)容總堿含量測(cè)定以及指紋圖譜進(jìn)行研究,為其質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索了其功效作用機(jī)制,對(duì)該類功效成分的后續(xù)深入開發(fā)研究提供了基礎(chǔ)。通過(guò)探索苦木生物堿對(duì)IDO的抑制作用及構(gòu)效關(guān)系,為該類新型高效的IDO抑制劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：煙臺(tái)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R284;R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2635040