【摘要】：肝癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率處于前五位的常見惡性腫瘤。我國肝癌的發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌,而死亡率僅低于肺癌。目前,治療肝癌的首選手段為手術(shù)切除和肝移植。研究表明包括肝癌在內(nèi)的惡性腫瘤細(xì)胞中存在著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及擔(dān)負(fù)其應(yīng)激信號傳導(dǎo)任務(wù)的未折疊蛋白反應(yīng)影響細(xì)胞的命運(yùn)。南蛇藤素是自我國傳統(tǒng)中藥材南蛇藤根部分離得到的三萜類天然化合物。因南蛇藤素對NF-?B信號通路有抑制作用,其抗炎作用具有較高的研發(fā)潛力。近年的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)南蛇藤素亦具有潛在的抗腫瘤作用。本研究的目的是探討南蛇藤素對肝癌抗腫瘤活性的分子機(jī)制。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量的南蛇藤素對兩種人肝癌細(xì)胞Hep G2和Bel7402的抑制作用。利用CCK-8法、平板克隆集落形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和western blot實(shí)驗(yàn)檢測南蛇藤素對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。采用PI/AnnexinⅤ雙標(biāo)記法、TUNEL染色法和western blot實(shí)驗(yàn)觀察南蛇藤素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的情況。使用流式細(xì)胞術(shù)和western blot實(shí)驗(yàn)分別檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度以及泛素化蛋白和參與蛋白合成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶表達(dá),觀察南蛇藤素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的情況。使用q PCR實(shí)驗(yàn)、western blot實(shí)驗(yàn)和CCK-8法觀察南蛇藤素誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)的情況。應(yīng)用生物電鏡和western blot實(shí)驗(yàn)觀察南蛇藤素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬的情況,利用CCK-8法和western blot實(shí)驗(yàn)觀察南蛇藤素誘導(dǎo)的自噬對肝癌細(xì)胞的作用。利用小鼠肝癌細(xì)胞H22的BALB/c小鼠荷瘤模型,觀察南蛇藤素灌胃給藥對荷瘤小鼠的療效。研究結(jié)果顯示,南蛇藤素可以抑制Hep G2和Bel7402的細(xì)胞活力及克隆形成能力。南蛇藤素可誘導(dǎo)Hep G2和Bel7402處于G2/M期細(xì)胞增多,南蛇藤素的這種細(xì)胞周期阻滯作用可能與其介導(dǎo)的兩種細(xì)胞中,細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21表達(dá)增加和cyclin B1表達(dá)減少有關(guān)。南蛇藤素可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。南蛇藤素作用下Hep G2和Bel7402的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和PARP活化明顯增強(qiáng)。兩種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶PDI和Ero1-L?蛋白表達(dá)下降提示南蛇藤素處理的肝癌細(xì)胞處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。而南蛇藤素使兩種肝癌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度和泛素化蛋白表達(dá)量升高可能是南蛇藤素作用下,肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增強(qiáng)的壓力信號。經(jīng)南蛇藤素處理的肝癌細(xì)胞中,未折疊蛋白反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白el F2?和IRE1?的磷酸化水平升高,未折疊蛋白反應(yīng)的相關(guān)蛋白Bip及其下游轉(zhuǎn)錄因子ATF4、CHOP和XBP1s的m RNA表達(dá)水平升高。聯(lián)合使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解劑TUDCA相比于單獨(dú)使用南蛇藤素處理肝癌細(xì)胞,Hep G2和Bel7402的活力有所恢復(fù),Hep G2細(xì)胞中的el F2?和IRE1?的磷酸化程度降低,ATF4和CHOP的m RNA表達(dá)水平有所降低,凋亡蛋白caspase-3和PARP的活化程度降低。生物電鏡下觀察經(jīng)南蛇藤素處理的肝癌細(xì)胞,可見包含內(nèi)容物的吞噬泡。南蛇藤素處理的肝癌細(xì)胞中LC3表達(dá)增強(qiáng)。使用自噬抑制劑3-MA與南蛇藤素共同處理肝癌細(xì)胞,相比于單獨(dú)使用南蛇藤素,LC3表達(dá)減弱,Hep G2細(xì)胞活力降低和Bel7402細(xì)胞的活力增強(qiáng)。使用南蛇藤素灌胃治療小鼠肝癌細(xì)胞H22的BALB/c小鼠荷瘤模型,使用5mg/kg劑量每日灌胃給藥組小鼠的腫瘤體積明顯小于溶劑對照組。溶劑對照組、2.5mg/kg劑量灌胃給藥組和5mg/kg劑量灌胃給藥組的小鼠體重變化無明顯差異。藥物治療組小鼠與溶劑對照組小鼠血液中反映肝腎功能的指標(biāo)無明顯差異。免疫組化染色顯示給藥組小鼠相對于溶劑對照組,其腫瘤組織中活化的caspase-3表達(dá)量更高。結(jié)論:南蛇藤素可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯,抑制肝癌細(xì)胞的增殖。南蛇藤素作用下,肝癌細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡和泛素化蛋白蓄積,以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解劑TUDCA可降低南蛇藤素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中凋亡標(biāo)志蛋白的表達(dá),提示南蛇藤素可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡。南蛇藤素可誘導(dǎo)兩種肝癌細(xì)胞的自噬,使用自噬抑制劑3-MA的結(jié)果提示南蛇藤素誘導(dǎo)的自噬在兩種肝癌細(xì)胞中的作用有所不同。在小鼠肝癌細(xì)胞H22的BALB/c小鼠荷瘤模型中,南蛇藤素抑制小鼠肝癌生長。
【圖文】：

圖 1.2 南蛇藤素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Figure 1.2 Celastrol induces apoptosis制蛋白酶體活性被視作一種蛋白酶體的抑制劑[67,68]。泛素-蛋質(zhì)的重要路徑。泛素-蛋白酶體途徑主要包

Sapieha P. Cell Metab. 2015 Oct 6;22(4):560-75.圖 1.3 未折疊蛋白反應(yīng)Figure 1.3 Unfolded protein response當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，Bip 與上述三個蛋白解離，結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊蛋白發(fā)揮分子伴侶作用，幫助這些蛋白完成折疊或引導(dǎo)其降解。與 Bip 解離的
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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1 李f

本文編號：2634944