【摘要】：第一部分SCD1及脂滴在多發(fā)性骨髓瘤中的表達及意義目的:既往研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中通過抑制硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)表達破壞脂質穩(wěn)態(tài)可以殺傷腫瘤細胞,但目前SCD1在多發(fā)性骨髓瘤(MM)發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。本部分研究旨在了解脂肪酸組成調節(jié)關鍵酶SCD1在MM中的表達,及其在MM脂質代謝和細胞存活中的作用。方法:收集自2016年10月至2018年5月在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院的16例多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓標本和5例健康人外周血,密度梯度離心法分離單個核細胞,實時PCR檢測脂質合成基因SCD1表達水平,統(tǒng)計分析SCD1表達與MM臨床特征的相關性;生物信息學分析比較126名初治骨髓瘤患者的CD138+MM細胞和18名骨髓瘤患者骨髓CD138-CD19+B細胞的SCD1表達;選取兩個骨髓瘤細胞系RPMI8226和ARH77,免疫印跡法檢測SCD1蛋白水平,BODIPY 493/503熒光染色檢測細胞內脂滴(lipid droplets,LDs)的含量。si RNA-SCD1轉染MM細胞敲降SCD1表達,檢測SCD1對脂滴含量及MM細胞活性的影響,并分別補充外源性油酸(OA)或棕櫚酸(PA),觀察脂滴含量及MM細胞活性的變化。結果:在MM患者樣本中,SCD1的表達明顯高于健康供者,而其表達與患者、年齡或性別無相關性。生物信息學分析顯示,初治骨髓瘤患者的CD138+MM細胞的SCD1表達高于患者骨髓中的CD19+B細胞。與正常B細胞相比,MM細胞系RPMI8226和ARH77中SCD1的表達顯著升高,且MM細胞中的LDs含量高于正常B細胞。與對照組相比,si RNA-SCD1組細胞凋亡增加,并伴隨LDs含量的明顯降低。我們發(fā)現(xiàn)補充外源性油酸后OA+si RNA-SCD1組凋亡細胞比例較si RNA-SCD1組降低,而且細胞內LDs含量增加。結論:本部分研究表明,多發(fā)性骨髓瘤細胞中存在SCD1的高表達和脂質存儲水平的增加,且SCD1的表達與MM臨床分期相關,SCD1的表達影響MM細胞內脂滴含量和MM細胞存活能力,提示SCD1可能是干擾脂質代謝促進MM細胞凋亡的重要靶點。第二部分原人參三醇通過下調SCD1表達誘導內質網(wǎng)應激促進多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡目的:原人參三醇(PPT)是一種人參提取物,具有調節(jié)代謝紊亂和抑制脂質合成作用,在多種腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用,而對MM細胞增殖、凋亡的作用尚不清楚。本部分研究探討了原人參三醇對MM細胞生物學功能的影響和作用機制,及其在MM中對SCD1介導的脂質代謝的調控作用。方法:選取RPMI8226和ARH77兩種多發(fā)性骨髓瘤細胞株,不同濃度原人參三醇作用于細胞,CCK8檢測細胞活力和增殖,計算藥物IC50,流式細胞術檢測細胞凋亡、細胞周期,western blotting檢測凋亡蛋白、細胞周期相關蛋白表達。設置PPT干預組和DMSO組,q RT-PCR檢測SCD1表達量,檢測內質網(wǎng)應激相關基因XBP-1、GRP78、ATF4m RNA表達;western blotting檢測SCD1和內質網(wǎng)應激凋亡通路相關蛋白p-PERK,PERK,CHOP的表達;補充油酸或棕櫚酸,流式檢測細胞凋亡,q RT-PCR和蛋白印跡檢測上述蛋白的表達。免疫熒光檢測PPT組和對照組細胞內LDs水平,并檢測補充外源性油酸或棕櫚酸后各組細胞細胞內LDs水平改變。結果:在RPMI8226和ARH77細胞系中PPT劑量依賴性抑制細胞活力和增殖。流式細胞術分析結果顯示隨著濃度的增加,PPT的促凋亡作用增強,細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)PPT誘導MM細胞周期在G0/G1期停滯。q RT-PCR和western blotting實驗結果表明PPT顯著下調MM細胞中SCD1的表達,補充棕櫚酸的PA+PPT處理組細胞中SCD1的表達顯著增加,而OA+PPT組細胞SCD1表達無顯著改變。PPT降低了MM細胞中LDs水平,而油酸或棕櫚酸的補充使細胞中LDs水平升高。細胞活力和細胞凋亡檢測顯示油酸的補充不僅補救了PPT處理的MM細胞的活力,而且部分逆轉了PPT誘導的MM細胞凋亡。PPT誘導ER應激相關蛋白P-PERK和CHOP高表達,補充油酸逆轉了PPT誘導的內質網(wǎng)應激。PPT和ER應激抑制劑TUDCA聯(lián)合處理組細胞凋亡比例較PPT單獨處理組減少,進一步證實PPT可誘導MM細胞ER應激相關細胞凋亡。結論:本實驗研究結果表明原人參三醇具有抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖,誘導細胞凋亡的作用。SCD1是飽和脂肪酸轉化為不飽和脂肪酸的關鍵調節(jié)因子,PPT抑制SCD1的表達,下調細胞內LDs含量,干擾細胞脂質穩(wěn)態(tài),并進一步誘導MM細胞脂毒性相關內質網(wǎng)應激致細胞凋亡。第三部分體內實驗驗證原人參三醇抗多發(fā)性骨髓瘤的作用及機制目的:體外實驗已證明原人參三醇通過干擾SCD1介導的脂肪酸合成抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖及活性的作用,體內實驗進一步驗證原人參三醇對多發(fā)性骨髓瘤的殺傷作用及機制。方法:在NOD/SCID小鼠中皮下注射RPMI8226細胞構建MM小鼠模型,設置PPT治療組及PBS對照組,觀察小鼠的生存狀況,瘤體大小及體重變化;取小鼠瘤體,組織石蠟包埋切片標本,免疫組化染色檢測Ki67(一種增殖能力的標志物)、凋亡蛋白裂解caspase3、SCD1的表達,免疫熒光檢測SCD1、CHOP的表達。結果:與PBS注射對照組相比,PPT治療組小鼠腫瘤生長顯示出中度受抑制,且小鼠的體重明顯低于對照組。取小鼠瘤體測量并計算腫瘤體積結果顯示PPT治療組的腫瘤體積明顯較小。免疫熒光檢測瘤體中SCD1、CHOP水平,我們觀察到SCD1和ER應激之間存在顯著的反向關系。用IHC染色來檢測小鼠腫瘤組織中SCD1的表達結果顯示與對照組相比,PPT處理的小鼠腫瘤樣本SCD1的表達降低。此外,PPT治療的腫瘤組織中Ki-67的表達水平降低,且凋亡蛋白裂解caspase3的表達水平升高。結論:小鼠體內實驗驗證PPT抑制MM瘤體生長,抑制脂質去飽和酶SCD1表達,誘導ER應激促進凋亡。
【圖文】：

30圖 2 SCD1 是 MM 脂肪儲存和細胞存活所必需。（A）RPMI8226和ARH77細胞用siRNA轉染敲降SCD1，分為siRNA-SCD1組（50nM、100nM）和 SCR 對照組。在 siRNA 轉導后第 3 天進行 western blot 分析以評估 SCD1的抑制作用。（B）補充 100μM 油酸（OA）或棕櫚酸（PA）培養(yǎng) SCD1 敲降（100nM）

圖 3 PPT 對 MM 細胞增殖和存活的影響。不同濃度（0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml 和 50μg/ml）PPT 處理 RPMI8226和 ARH77 細胞 24h：（A）（B）CCK-8 法測定細胞增殖和活性，Annexin V /PI 染色并流式細胞術測定細胞凋亡；（C）流式細胞術測 PPT 處理組和對照組細胞的細胞周期（G0/G1 期、G2/M 期、S 期）；（D）收集細胞提取蛋白，，Western blotting 法檢測凋亡蛋白 PARP、cleaved caspase3 和細胞周期蛋白 cdc25A、CDK2 和 cyclinA2 的表達。（E）PPT 處理 RPMI8226 和 ARH77 細胞，與 100μm 棕櫚酸（PA）或油酸（OA）共培養(yǎng)24 小時，以 DMSO 處理的細胞作為對照。CCK-8 法檢測細胞增殖和活性。（F）AnnexinV/PI 染色流式細胞術分析經(jīng)處理的 RPMI8226 細胞的凋亡。圖中所示數(shù)據(jù)均為三個獨立實驗的平均值±標準差。***P<0.001，*P<0.05，**P<0.01。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2633946