【摘要】：第一部分SCD1及脂滴在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及意義目的:既往研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中通過抑制硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)表達(dá)破壞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)可以殺傷腫瘤細(xì)胞,但目前SCD1在多發(fā)性骨髓瘤(MM)發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。本部分研究旨在了解脂肪酸組成調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶SCD1在MM中的表達(dá),及其在MM脂質(zhì)代謝和細(xì)胞存活中的作用。方法:收集自2016年10月至2018年5月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院的16例多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓標(biāo)本和5例健康人外周血,密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞,實(shí)時(shí)PCR檢測脂質(zhì)合成基因SCD1表達(dá)水平,統(tǒng)計(jì)分析SCD1表達(dá)與MM臨床特征的相關(guān)性;生物信息學(xué)分析比較126名初治骨髓瘤患者的CD138+MM細(xì)胞和18名骨髓瘤患者骨髓CD138-CD19+B細(xì)胞的SCD1表達(dá);選取兩個(gè)骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226和ARH77,免疫印跡法檢測SCD1蛋白水平,BODIPY 493/503熒光染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴(lipid droplets,LDs)的含量。si RNA-SCD1轉(zhuǎn)染MM細(xì)胞敲降SCD1表達(dá),檢測SCD1對(duì)脂滴含量及MM細(xì)胞活性的影響,并分別補(bǔ)充外源性油酸(OA)或棕櫚酸(PA),觀察脂滴含量及MM細(xì)胞活性的變化。結(jié)果:在MM患者樣本中,SCD1的表達(dá)明顯高于健康供者,而其表達(dá)與患者、年齡或性別無相關(guān)性。生物信息學(xué)分析顯示,初治骨髓瘤患者的CD138+MM細(xì)胞的SCD1表達(dá)高于患者骨髓中的CD19+B細(xì)胞。與正常B細(xì)胞相比,MM細(xì)胞系RPMI8226和ARH77中SCD1的表達(dá)顯著升高,且MM細(xì)胞中的LDs含量高于正常B細(xì)胞。與對(duì)照組相比,si RNA-SCD1組細(xì)胞凋亡增加,并伴隨LDs含量的明顯降低。我們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充外源性油酸后OA+si RNA-SCD1組凋亡細(xì)胞比例較si RNA-SCD1組降低,而且細(xì)胞內(nèi)LDs含量增加。結(jié)論:本部分研究表明,多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中存在SCD1的高表達(dá)和脂質(zhì)存儲(chǔ)水平的增加,且SCD1的表達(dá)與MM臨床分期相關(guān),SCD1的表達(dá)影響MM細(xì)胞內(nèi)脂滴含量和MM細(xì)胞存活能力,提示SCD1可能是干擾脂質(zhì)代謝促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡的重要靶點(diǎn)。第二部分原人參三醇通過下調(diào)SCD1表達(dá)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡目的:原人參三醇(PPT)是一種人參提取物,具有調(diào)節(jié)代謝紊亂和抑制脂質(zhì)合成作用,在多種腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用,而對(duì)MM細(xì)胞增殖、凋亡的作用尚不清楚。本部分研究探討了原人參三醇對(duì)MM細(xì)胞生物學(xué)功能的影響和作用機(jī)制,及其在MM中對(duì)SCD1介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用。方法:選取RPMI8226和ARH77兩種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株,不同濃度原人參三醇作用于細(xì)胞,CCK8檢測細(xì)胞活力和增殖,計(jì)算藥物IC50,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期,western blotting檢測凋亡蛋白、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)。設(shè)置PPT干預(yù)組和DMSO組,q RT-PCR檢測SCD1表達(dá)量,檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因XBP-1、GRP78、ATF4m RNA表達(dá);western blotting檢測SCD1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路相關(guān)蛋白p-PERK,PERK,CHOP的表達(dá);補(bǔ)充油酸或棕櫚酸,流式檢測細(xì)胞凋亡,q RT-PCR和蛋白印跡檢測上述蛋白的表達(dá)。免疫熒光檢測PPT組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)LDs水平,并檢測補(bǔ)充外源性油酸或棕櫚酸后各組細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)LDs水平改變。結(jié)果:在RPMI8226和ARH77細(xì)胞系中PPT劑量依賴性抑制細(xì)胞活力和增殖。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示隨著濃度的增加,PPT的促凋亡作用增強(qiáng),細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)PPT誘導(dǎo)MM細(xì)胞周期在G0/G1期停滯。q RT-PCR和western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PPT顯著下調(diào)MM細(xì)胞中SCD1的表達(dá),補(bǔ)充棕櫚酸的PA+PPT處理組細(xì)胞中SCD1的表達(dá)顯著增加,而OA+PPT組細(xì)胞SCD1表達(dá)無顯著改變。PPT降低了MM細(xì)胞中LDs水平,而油酸或棕櫚酸的補(bǔ)充使細(xì)胞中LDs水平升高。細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡檢測顯示油酸的補(bǔ)充不僅補(bǔ)救了PPT處理的MM細(xì)胞的活力,而且部分逆轉(zhuǎn)了PPT誘導(dǎo)的MM細(xì)胞凋亡。PPT誘導(dǎo)ER應(yīng)激相關(guān)蛋白P-PERK和CHOP高表達(dá),補(bǔ)充油酸逆轉(zhuǎn)了PPT誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。PPT和ER應(yīng)激抑制劑TUDCA聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡比例較PPT單獨(dú)處理組減少,進(jìn)一步證實(shí)PPT可誘導(dǎo)MM細(xì)胞ER應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明原人參三醇具有抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。SCD1是飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,PPT抑制SCD1的表達(dá),下調(diào)細(xì)胞內(nèi)LDs含量,干擾細(xì)胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài),并進(jìn)一步誘導(dǎo)MM細(xì)胞脂毒性相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致細(xì)胞凋亡。第三部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證原人參三醇抗多發(fā)性骨髓瘤的作用及機(jī)制目的:體外實(shí)驗(yàn)已證明原人參三醇通過干擾SCD1介導(dǎo)的脂肪酸合成抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖及活性的作用,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證原人參三醇對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的殺傷作用及機(jī)制。方法:在NOD/SCID小鼠中皮下注射RPMI8226細(xì)胞構(gòu)建MM小鼠模型,設(shè)置PPT治療組及PBS對(duì)照組,觀察小鼠的生存狀況,瘤體大小及體重變化;取小鼠瘤體,組織石蠟包埋切片標(biāo)本,免疫組化染色檢測Ki67(一種增殖能力的標(biāo)志物)、凋亡蛋白裂解caspase3、SCD1的表達(dá),免疫熒光檢測SCD1、CHOP的表達(dá)。結(jié)果:與PBS注射對(duì)照組相比,PPT治療組小鼠腫瘤生長顯示出中度受抑制,且小鼠的體重明顯低于對(duì)照組。取小鼠瘤體測量并計(jì)算腫瘤體積結(jié)果顯示PPT治療組的腫瘤體積明顯較小。免疫熒光檢測瘤體中SCD1、CHOP水平,我們觀察到SCD1和ER應(yīng)激之間存在顯著的反向關(guān)系。用IHC染色來檢測小鼠腫瘤組織中SCD1的表達(dá)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,PPT處理的小鼠腫瘤樣本SCD1的表達(dá)降低。此外,PPT治療的腫瘤組織中Ki-67的表達(dá)水平降低,且凋亡蛋白裂解caspase3的表達(dá)水平升高。結(jié)論:小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PPT抑制MM瘤體生長,抑制脂質(zhì)去飽和酶SCD1表達(dá),誘導(dǎo)ER應(yīng)激促進(jìn)凋亡。
【圖文】：

30圖 2 SCD1 是 MM 脂肪儲(chǔ)存和細(xì)胞存活所必需。（A）RPMI8226和ARH77細(xì)胞用siRNA轉(zhuǎn)染敲降SCD1，分為siRNA-SCD1組（50nM、100nM）和 SCR 對(duì)照組。在 siRNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)后第 3 天進(jìn)行 western blot 分析以評(píng)估 SCD1的抑制作用。（B）補(bǔ)充 100μM 油酸（OA）或棕櫚酸（PA）培養(yǎng) SCD1 敲降（100nM）

圖 3 PPT 對(duì) MM 細(xì)胞增殖和存活的影響。不同濃度（0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml 和 50μg/ml）PPT 處理 RPMI8226和 ARH77 細(xì)胞 24h：（A）（B）CCK-8 法測定細(xì)胞增殖和活性，Annexin V /PI 染色并流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡；（C）流式細(xì)胞術(shù)測 PPT 處理組和對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞周期（G0/G1 期、G2/M 期、S 期）；（D）收集細(xì)胞提取蛋白，，Western blotting 法檢測凋亡蛋白 PARP、cleaved caspase3 和細(xì)胞周期蛋白 cdc25A、CDK2 和 cyclinA2 的表達(dá)。（E）PPT 處理 RPMI8226 和 ARH77 細(xì)胞，與 100μm 棕櫚酸（PA）或油酸（OA）共培養(yǎng)24 小時(shí)，以 DMSO 處理的細(xì)胞作為對(duì)照。CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖和活性。（F）AnnexinV/PI 染色流式細(xì)胞術(shù)分析經(jīng)處理的 RPMI8226 細(xì)胞的凋亡。圖中所示數(shù)據(jù)均為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。***P<0.001，*P<0.05，**P<0.01。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2633946