【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種系統(tǒng)性、炎癥性自身免疫性疾病,其表現(xiàn)為持續(xù)性的慢性滑膜炎,形成大量血管翳,進一步導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞,甚至引發(fā)畸形病變以及嚴(yán)重的并發(fā)癥。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是RA疾病發(fā)生過程中的主要效應(yīng)細(xì)胞,呈腫瘤細(xì)胞樣生長,并通過分泌高水平炎性細(xì)胞因子、趨化因子、基質(zhì)蛋白降解酶等,調(diào)控血管翳的形成,在關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞過程中發(fā)揮重要作用。RA病變中細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞增殖與凋亡、浸潤生長等多種病理改變均與細(xì)胞骨架的變化有關(guān)。纖維狀肌動蛋白(filamentous actin,F-actin),是維持細(xì)胞形態(tài)和功能的基本細(xì)胞骨架,多種刺激可以引起其形態(tài)學(xué)改變,引發(fā)血-關(guān)節(jié)囊液屏障等生理性屏障通透性的增加,從而損傷其功能。研究表明,F-actin可由滑膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達,受Rho A、p38MAPK、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factorκB,NF-κB)等信號通路調(diào)控。梔子苷(Geniposide,GE)是從茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis中提取純化得到的環(huán)烯醚萜苷類化合物,具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗血管生成以及抗糖尿病等多種藥理作用。牛膝總皂苷(Achyranthes bidentata saponins,ABS)為莧科植物牛膝(Achyranthes bidentata BI.)的主要活性成分,牛膝常被用作引藥,能夠引經(jīng)報使,引諸藥下行到達人體下半身,治療人體下半身疾病的作用。課題組的前期實驗結(jié)果證實:GE對佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠有抗炎免疫調(diào)節(jié)作用,能夠抑制AA大鼠FLS細(xì)胞增殖;下調(diào)AA大鼠FLS中白介素(interleukin,IL)-6、IL-17、干擾素-γ(Interferon-gama,IFN-γ)等炎性細(xì)胞因子的分泌水平,上調(diào)IL-4、轉(zhuǎn)錄生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等抗炎細(xì)胞因子的分泌水平;下調(diào)AA大鼠FLS中p38MAPK的磷酸化水平;ABS能夠提高GE在AA大鼠關(guān)節(jié)腔組織中的靶向分布,對GE具有靶向引導(dǎo)作用。本課題采用AA大鼠模型,以RA的主要效應(yīng)細(xì)胞FLS為研究對象,通過觀察GE、ABS單用及合用對FLS功能的影響,探討FLS表達F-actin水平的改變,研究Rho A調(diào)控p38MAPK/NF-κB/F-actin在AA大鼠FLS中的異常變化及作用機制,為中藥有效成分的研究與應(yīng)用提供更多的實驗依據(jù)。目的:觀察GE、ABS單用及合用對AA大鼠FLS細(xì)胞增殖的影響;觀察GE、ABS單用及合用對AA大鼠FLS分泌細(xì)胞因子水平的影響;觀察GE、ABS單用及合用對AA大鼠FLS中Rho A、p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB p65、NF-κB p-p65和F-actin蛋白表達水平的影響,為揭示F-actin參與RA異常炎癥反應(yīng)的病理機制,為中藥有效成分對RA的預(yù)防與治療提供新的研究思路。方法:Sprague-Dawley(SD)大鼠左后足足跖皮下注射弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant,FCA)制備AA大鼠模型,于致炎后d7-d21進行大鼠全身評分、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分及足爪腫脹度測定。致炎后d21腹主動脈取血處死AA大鼠,組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)FLS,傳至第3代時,體外給藥,分組情況如下:control組:空白的DMEM培養(yǎng)液,脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)組:5μg/m L LPS,GE單用組(25,50,100μg/m L),ABS單用組(40μg/m L),ABS與GE合用組(40+25,40+50,40+100μg/m L)及Rho A/ROCK抑制劑Y-27632組(10μM)。CCK-8法篩選出GE與ABS的給藥濃度后,檢測GE、ABS單用及合用對AA大鼠FLS細(xì)胞增殖的影響;ELISA法檢測各給藥組對AA大鼠FLS細(xì)胞上清中IL-1β、IL-17、IL-4和TGF-β1的含量的影響;蛋白質(zhì)電泳法(Western-blot)法檢測各給藥組對AA大鼠FLS中Rho A、p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB p65、NF-κB p-p65及F-actin蛋白的表達量的影響。結(jié)果:1 GE、ABS單用及合用對AA大鼠FLS細(xì)胞增殖的影響GE體外刺激AA大鼠FLS細(xì)胞增殖的合適濃度為(25,50,100μg/m L),GE的亞適濃度(50μg/m L)與五個不同濃度的ABS合用刺激AA大鼠FLS細(xì)胞增殖后,選擇40μg/m L作為ABS的給藥濃度。與正常組相比,LPS組FLS細(xì)胞增殖亢進(P0.01)。與LPS組相比,ABS單用組(40μg/m L)對LPS誘導(dǎo)的AA大鼠FLS細(xì)胞增殖能力無顯著影響,GE單用組(25,50,100μg/m L)、ABS與GE合用組(40+25,40+50,40+100μg/m L)對FLS的細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用(P0.05,P0.01),Y-27632抑制劑組(10μM)亦可顯著抑制FLS的細(xì)胞增殖能力(P0.01)。ABS與GE合用組(40+25,40+50,40+100μg/m L)與GE單用組(25,50,100μg/m L)分別比較,ABS與中、高劑量GE合用組(40+50,40+100μg/m L)對FLS細(xì)胞增殖均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。2 GE、ABS單用及合用對AA大鼠FLS分泌細(xì)胞因子的影響與正常組相比,LPS組FLS中IL-1和IL-17的分泌量明顯上調(diào),IL-4和TGF-β1的分泌量顯著下調(diào)(P0.01)。與LPS組比較,ABS單用組(40μg/m L)對AA大鼠FLS分泌的IL-1β、IL-17、IL-4和TGF-β1無顯著性差異;GE單用組(25,50,100μg/m L)、ABS與GE合用組(40+25,40+50,40+100μg/m L)對AA大鼠FLS中IL-1、IL-17的分泌水平顯著減少,IL-4、TGF-β1的分泌水平顯著增加(P0.05,P0.01);Y-27632抑制劑組(10μM)對FLS中IL-1β、IL-17的分泌量亦顯著降低,IL-4、TGF-β1的分泌量亦顯著增多(P0.01)。與GE單用組(25,50,100μg/m L)分別比較,僅ABS與中、高劑量GE合用組(40+50,40+100μg/m L)對FLS中IL-1β和IL-4的分泌水平有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3 GE、ABS單用及合用對AA大鼠FLS中Rho A、p38MAPK、NF-κB及F-actin蛋白表達的影響與正常組相比,LPS組FLS中的Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin的蛋白表達水平顯著升高(P0.01)。與LPS組比較,ABS單用組(40μg/m L)對AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin的蛋白表達水平無顯著性差異;GE單用組(25,50,100μg/m L)可顯著下調(diào)AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK和F-actin蛋白的表達(P0.05,P0.01),僅在GE中、高劑量組(50,100μg/m L)對NF-κB p-p65蛋白的表達水平有顯著性差異(P0.05,P0.01);ABS與GE合用組(40+25,40+50,40+100μg/m L)對AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin水平均明顯降低(P0.05,P0.01);Y-27632抑制劑組(10μM)對AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin蛋白水平亦顯著性降低(P0.01)。ABS與GE合用組與GE單用組分別比較,ABS的與中劑量GE合用組(40+50μg/m L)對AA大鼠FLS中p-p38MAPK和F-actin的蛋白表達水平有顯著差異(P0.05),ABS與高劑量GE合用組(40+100μg/m L)對FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65和F-actin的蛋白表達水平均有顯著差異(P0.05)。結(jié)論:1.LPS組FLS細(xì)胞增殖亢進;FLS分泌的炎性細(xì)胞因子IL-1和IL-17水平明顯增加,抑炎細(xì)胞因子IL-4和TGF-β水平明顯降低;FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin的蛋白表達水平均顯著增加。2.GE能夠顯著抑制AA大鼠FLS增殖亢進,可明顯降低AA大鼠FLS中炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-17的分泌水平,顯著升高抑炎細(xì)胞因子IL-4和TGF-β1的分泌水平;可明顯減少AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65和F-actin的蛋白表達水平,阻斷Rho A對p38MAPK/NF-κB/F-actin的調(diào)控,達到抑制AA大鼠FLS細(xì)胞增殖,恢復(fù)促炎細(xì)胞因子/抗炎細(xì)胞因子之間的動態(tài)平衡,抑制炎癥發(fā)展的作用。3.ABS與低劑量GE合用(40+25μg/m L)時,對GE的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用無顯著影響,與中、高劑量GE合用(40+50,40+100μg/m L)時可增強GE的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用。
【圖文】：

4.3 CCK-8法檢測各給藥組對AA大鼠FLS細(xì)胞增殖的影響4.3.1 不同濃度GE對AA大鼠FLS細(xì)胞增殖的影響LPS（5 μg/mL）體外刺激 AA 大鼠 FLS，同時設(shè) GE（6.25, 12.5, 25, 50, 100μg/mL）五個濃度組，37 °C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h 后，CCK-8 法檢測 450 nm波長處 OD 值。結(jié)果如 Fig. 2，GE（25, 50, 100 μg/mL）給藥組對 LPS 誘導(dǎo)的 AA大鼠 FLS 細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用（P<0.05, P<0.01），且呈劑量依賴的趨勢，故在接下來的試驗中選擇 25, 50, 100 μg/mL 作為 GE 的適宜濃度。圖 1 大鼠FLS的形態(tài)學(xué)觀察（A：原代d3，， B：原代d7，C：原代d11，D：傳 3 代細(xì)胞）Fig.1 FLS morphology.A: Primary culture of FLS on 3 days;A: Primary culture of FLS on 7days; C: Primary culture of FLS on 11 days; D: The third generation of FLS.

4.3.2 GE（50 μg/mL）與不同濃度 ABS 合用對 AA 大鼠 FLS 細(xì)胞增殖的影響用五個不同濃度 ABS（5, 10, 20, 40, 80 μg/mL）與 GE 的亞試濃度（50 μg/mL）合用后體外作用 AA 大鼠 FLS，37 °C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h 后，CCK-8 法測定 450 nm 波長處 OD 值。結(jié)果如 Fig. 3 所示，與 LPS 組比較，GE 單用組（50μg/mL）、GE 與五個不同濃度 ABS 合用組（50+5, 50+10, 50+20, 50+40, 50+80μg/mL）對 AA 大鼠 FLS 的細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用（P<0.01）；與 GE 單用組比較，GE 與 ABS（50+40, 50+80 μg/mL）合用組對 AA 大鼠 FLS 的細(xì)胞增殖有下調(diào)趨勢（P<0.05），故在接下來的實驗中選擇 40 μg/mL 作為 ABS 的給藥濃度。圖 2 不同濃度 GE 體外給藥對 AA 大鼠 FLS 細(xì)胞增殖的影響（ x ±s, n=3）Fig. 2 Effects of GE on the proliferation of FLS onAArats in vitro.##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs AAgroup.
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 LV Qi;ZHU Xian-Yang;XIA Yu-Feng;DAI Yue;WEI Zhi-Feng;;Tetrandrine inhibits migration and invasion of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes through down-regulating the expressions of Rac1, Cdc42, and Rho A GTPases and activation of the PI3K/Akt and JNK signaling pathways[J];Chinese Journal of Natural Medicines;2015年11期

2 呂邵娃;王秋實;趙爽;孟濤;王蘊哲;郭玉巖;匡海學(xué);;中藥調(diào)控類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎核因子κB信號通路的研究進展[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2015年11期

3 秦蘇萍;李慧;李小翠;王曉天;湯仁仙;孫德旭;;CIA大鼠滑膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定[J];免疫學(xué)雜志;2014年12期

4 施冬艷;李霞;陳海鳳;陸智敏;孫凌云;;ROS對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者骨髓MSC細(xì)胞骨架F-actin的影響[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2014年04期

5 乙軍;劉守正;馬小波;劉加元;張成亮;李業(yè)成;吳新鋮;;牛膝對塞來昔布治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的影響[J];中國中醫(yī)骨傷科雜志;2013年10期

6 丁娟;王志軍;董曉薇;張淑雅;蘆曉紅;趙薇;;RA滑膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2012年36期

7 劉國生;孫備;呂凌;;牛膝“引藥下行”對雙氯芬酸鈉抗大鼠急性關(guān)節(jié)炎作用的影響[J];時珍國醫(yī)國藥;2012年10期

8 李培培;解國雄;宋珊珊;黃蓓;吳育晶;汪慶童;常艷;張運芳;周愛武;劉麗華;張玲玲;魏偉;;大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型表現(xiàn)特征及評價指標(biāo)[J];中國免疫學(xué)雜志;2012年05期

9 方年富;李弼民;;核因子κB信號通路的研究進展[J];重慶醫(yī)學(xué);2012年01期

10 梁柳琴;肖游君;付迪;林浩博;楊彥龍;葉玉津;詹鐘平;范瑾瑾;楊岫巖;許韓師;;RhoA/ROCK信號通路對TLR-2配體誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維滑膜細(xì)胞分泌趨化因子的調(diào)控作用[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2011年11期

本文編號：2633927