【摘要】：目的:探討竹節(jié)參總皂苷對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織炎癥和棕櫚酸(Palmitic acid,PA)誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞炎癥的干預(yù)作用,并進(jìn)一步研究其可能涉及的分子機(jī)制,以期為防治由高脂飲食引起的相關(guān)代謝性疾病提供新思路。方法:1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):以無(wú)特定病原體(Specific pathogen free,SPF)級(jí)BALB/c雄性小鼠為研究對(duì)象,隨機(jī)將50只8周齡小鼠分為正常飲食組、高脂模型組、竹節(jié)參總皂苷低、中和高劑量組,每組10只,每只小鼠體重18-20 g。竹節(jié)參總皂苷低、中和高劑量組分別灌胃給予竹節(jié)參總皂苷30 mg/kg、90 mg/kg、150 mg/kg,其余組別分別灌胃給予相應(yīng)的藥物溶劑0.5%羧甲基纖維素鈉,每周停藥1天,持續(xù)給藥4個(gè)月。給藥期間正常飲食組小鼠給予正常飼料,其余組別小鼠分別給予高脂飼料,每組小鼠自由飲食。在給藥喂養(yǎng)期間:(1)準(zhǔn)確記錄每只小鼠體重,并進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn);末次給藥結(jié)束后麻醉處死小鼠,摘眼球取血,觀察以下指標(biāo):(2)稱(chēng)取內(nèi)臟脂肪組織重量,計(jì)算內(nèi)臟脂肪指數(shù);(3)生化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠血清中葡萄糖、甘油三酯(Triglycerlide,TG)、總膽固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白-膽固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白-膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的含量;(4)蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)觀察小鼠附睪脂肪組織病理變化;(5)實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)小鼠脂肪組織相關(guān)炎癥因子腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)的mRNA表達(dá)水平;(6)Western blot法檢測(cè)小鼠脂肪組織相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-1β、iNOS的蛋白表達(dá)水平;(7)Western blot法檢測(cè)小鼠脂肪組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear transcription fatorκB,NF-κB)炎癥通路中磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Phosphorylated nuclear transcription fatorκB,pNF-κB)、總NF-κB、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白(Phosphorylated nuclear factor-κB-inhibitorκB,pIκB)、總核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白(Nuclear factor-κB-inhibitorκB,IκB)的蛋白表達(dá)水平,并比較各組小鼠脂肪組織中相應(yīng)蛋白磷酸化水平蛋白與總蛋白的比值變化;(8)實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)小鼠脂肪組織中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80、CD11b的mRNA表達(dá)水平;(9)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠附睪脂肪組織中巨噬細(xì)胞的比例。2、體外實(shí)驗(yàn):(1)噻唑藍(lán)(Ethylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法篩選竹節(jié)參總皂苷對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的安全藥物濃度;(2)運(yùn)用傳統(tǒng)的“雞尾酒”法將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞,油紅O染色法檢測(cè)成熟脂肪細(xì)胞是否分化成功;(3)將分化成功的成熟脂肪細(xì)胞用PA處理,在PA處理的同時(shí)加入不同濃度的竹節(jié)參總皂苷;(4)Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-1β、iNOS的蛋白表達(dá)水平;(5)Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB炎癥通路相關(guān)蛋白pNF-κB/NF-κB、pIκB/IκB的表達(dá)水平。結(jié)果:1,體內(nèi)實(shí)驗(yàn):(1)成功建立小鼠肥胖模型,在小鼠的喂養(yǎng)過(guò)程中,各組小鼠的體重增長(zhǎng)幅度差異明顯,與正常飲食組比較,高脂模型組小鼠的體重從9周齡開(kāi)始顯著升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01);與高脂模型組比較,各用藥組小鼠的體重增長(zhǎng)速率在不同喂養(yǎng)階段均明顯降低(p0.05或p0.01)。(2)與正常飲食組比較,高脂模型組小鼠內(nèi)臟脂肪指數(shù)顯著升高(p0.05),與高脂模型組比較,竹節(jié)參總皂苷處理后,各用藥組小鼠內(nèi)臟脂肪指數(shù)降低,且竹節(jié)參總皂苷高劑量組下降顯著(p0.01)。(3)各組小鼠給予葡萄糖0.5小時(shí)(Hour,h)后,血糖值相對(duì)于空腹血糖值均明顯升高;其中,高脂模型組小鼠的血糖值明顯高于正常飲食組(p0.01),而各用藥組的血糖值與高脂模型組比較均降低(p0.05),給予葡萄糖1 h至2.5 h期間,高脂模型組小鼠血糖值皆明顯高于正常飲食組(p0.01),竹節(jié)參總皂苷處理后,各用藥組血糖值均低于高脂模型組(p0.05或p0.01),各用藥組的血糖值變化曲線均位于正常飲食組和高脂模型組之間。(4)與正常飲食組比較,高脂模型組小鼠血清中葡萄糖、TG、TC、LDL-C的含量明顯上升(p0.05),HDL-C的含量明顯降低(p0.05);與高脂模型組相比,各用藥組小鼠血清中的葡萄糖、TG、TC、LDL-C的含量均降低,其中葡萄糖的降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),HDL-C的含量升高。(5)HE染色結(jié)果顯示,正常飲食組脂肪細(xì)胞排列緊密,大體呈圓形,大小均一;高脂模型組小鼠脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、大小不均,與正常飲食組比較,巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)形成的牙套狀結(jié)構(gòu)顯著增加(p0.01),脂肪細(xì)胞體積增大;與高脂模型組比較,各用藥組中高脂飲食所致的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少(p0.05),細(xì)胞體積減小,細(xì)胞形態(tài)明顯改善。(6)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,與正常飲食組比較,高脂模型組小鼠脂肪組織中TNF-α、IL-1β、iNOS、MCP-1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(p0.01);與高脂模型組比較,給予竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后,各用藥組小鼠脂肪組織中TNF-α、IL-1β、iNOS、MCP-1的mRNA表達(dá)水平顯著降低(p0.05)。(7)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常飲食組比較,高脂模型組小鼠脂肪組織中TNF-α、IL-1β、iNOS的蛋白表達(dá)水平顯著升高(p0.01);竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后,各用藥組TNF-α、IL-1β、iNOS的蛋白表達(dá)水平均降低(p0.05)。(8)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常飲食組比較,高脂模型組小鼠脂肪組織中pNF-κBp65/NF-κBp65、pIκB/IκB的蛋白表達(dá)水平顯著升高(p0.01);竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后,各用藥組小鼠脂肪組織中pNF-κBp65/NF-κBp65、pIκB/IκB的蛋白表達(dá)水平均降低(p0.05)。其中,正常飲食組、高脂模型組及各用藥組的總NF-κB、IκB、核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白激酶(Nuclear factor-κB-inhibitorκB kinase,IKK)的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。(9)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,與正常飲食組比較,高脂模型組小鼠脂肪組織中F4/80、CD11b的mRNA表達(dá)水平顯著升高(p0.01);與高脂模型組比較,各用藥組F4/80、CD11b的mRNA表達(dá)量均顯著降低(p0.01)。(10)流式細(xì)胞術(shù)分選結(jié)果顯示:高脂模型組內(nèi)臟脂肪組織中巨噬細(xì)胞的比例高于正常飲食組,而各用藥組經(jīng)竹節(jié)參總皂苷處理后其內(nèi)臟脂肪組織中巨噬細(xì)胞比例均減少。2,體外實(shí)驗(yàn):(1)成功將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟脂肪細(xì)胞,成熟脂肪細(xì)胞中的脂滴經(jīng)油紅O染成紅色;(2)MTT結(jié)果顯示,當(dāng)竹節(jié)參總皂苷濃度高于50μg/ml時(shí)細(xì)胞的增殖受到明顯抑制(p0.05或p0.01);藥物濃度低于50μg/ml,細(xì)胞的增殖則不受影響;因此我們將后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的安全藥物濃度定為50μg/ml;(3)Western blot結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,用PA處理過(guò)的模型組中相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-1β、iNOS的蛋白表達(dá)水平明顯升高(p0.01),竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后其表達(dá)量降低(p0.05);(4)Western blot結(jié)果顯示,模型組pNF-κBp65/NF-κBp65、pIκB/IκB的蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組(p0.01),而與模型組比較,竹節(jié)參總皂苷處理組pNF-κBp65/NF-κBp65、pIκB/IκB蛋白表達(dá)水平降低(p0.01),其中,空白對(duì)照組、模型組及各用藥組的總NF-κB、IκB、IKK的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。結(jié)論:竹節(jié)參總皂苷可明顯改善高脂飲食所致的脂肪組織慢性炎癥和PA誘導(dǎo)的成熟脂肪細(xì)胞炎癥,其作用機(jī)制與減少脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、抑制巨噬細(xì)胞向促炎型巨噬細(xì)胞極化、抑制脂肪組織及成熟脂肪細(xì)胞中的NF-κВ炎癥通路有關(guān)。
【圖文】：

圖 1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)小鼠體重、內(nèi)臟脂肪指數(shù)及葡萄糖耐量的影響ND：正常飲食組； HFD：高脂模型組；TSPJ 30mg/kg：竹節(jié)參總皂苷低劑量TSPJ 90mg/kg：竹節(jié)參總皂苷中劑量組；TSPJ 150mg/kg：竹節(jié)參總皂苷高劑與正常飲食組比較，，#p < 0.05，##P < 0.01；與高脂模型組比較，*P < 0.05，** P <

運(yùn)用實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)各組小鼠脂肪組織中炎癥因子 TNF-α、IL-1β、iNOS、MCP-1 mRNA 的表達(dá)。結(jié)果如圖2 所示，與正常飲食組相比，高脂模型組小鼠脂肪組織中 TNF-α、IL-1β、iNOS、MCP-1mRNA 表達(dá)水平顯著升高(p < 0.01)；與高脂模型組比較，給予竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后，
【學(xué)位授予單位】：三峽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2633277