【摘要】：目的:以THP-1細胞為載體,觀察荊芥揮發(fā)油及其主要成分胡薄荷酮抗炎作用的NLRP3炎癥小體調(diào)控機制,進一步完善荊芥揮發(fā)油與模式識別受體相關(guān)的抗炎作用機制研究。方法:采用GC-MS法測定荊芥揮發(fā)油的化學成分,MTS法測定荊芥揮發(fā)油對細胞的毒性作用。利用佛波酯(PMA)將THP-1細胞誘導分化為巨噬細胞,然后采用LPS與激活物(ATP、Nigericin、CPPD或CaCl_2)進行造模,觀察荊芥揮發(fā)油對NLRP3炎癥小體激活的影響:(1)ELISA法檢測細胞上清中IL-1β、IL-18、Caspase-1(p20)、Pro-IL-1β水平;(2)RT-PCR法檢測細胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1α、IL-6 mRNA的表達;(3)Western Blot法檢測細胞裂解液中Pro-IL-1β、NLRP3、Pro-Caspase-1和ASC蛋白表達;(4)熒光探針法測定細胞ROS含量,免疫熒光法測定Cathepsin B、NLRP3和ASC蛋白表達。結(jié)果:(1)荊芥揮發(fā)油中胡薄荷酮的相對含量為33.40%,為其主要成分之一。(2)荊芥揮發(fā)油和胡薄荷酮在≤0.4mg/mL濃度時對THP-1巨噬細胞無毒。(3)0.2mg/mL濃度荊芥揮發(fā)油和胡薄荷酮均對ATP、Nigericin、CPPD和CaCl_24種激活物誘導的THP-1巨噬細胞上清中IL-1β的高分泌具有明顯抑制作用(P0.05或P0.01),對ATP、Nigericin致細胞上清中Pro-IL-1β的分泌具有顯著下調(diào)作用(P0.05或P0.01);0.2mg/m L荊芥揮發(fā)油亦對ATP、Nigericin致細胞上清中IL-18的分泌有顯著降低作用(P0.05或P0.01)。(4)0.2mg/mL荊芥揮發(fā)油和胡薄荷酮對ATP誘導的THP-1巨噬細胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1α、IL-6 mRNA的高表達有顯著下調(diào)作用(P0.05或P0.01)。0.2mg/m L荊芥揮發(fā)油和胡薄荷酮對Nigericin致THP-1巨噬細胞中Caspase-1、IL-1β、IL-1α、IL-6 mRNA的表達具有下調(diào)作用(P0.05或P0.01),0.2mg/m L荊芥揮發(fā)油同時對NLRP3 mRNA的表達有降低作用(P0.05)。(5)0.2mg/m L荊芥揮發(fā)油和胡薄荷酮對Nigericin致THP-1巨噬細胞上清中Caspase-1(p20)蛋白表達有顯著降低作用(P0.05或P0.01),0.2mg/m L胡薄荷酮對ATP致細胞上清中Caspase-1(p20)蛋白表達亦有顯著降低作用(P0.05)。0.2mg/m L荊芥揮發(fā)油和胡薄荷酮對ATP致細胞裂解液中Pro-IL-1β蛋白表達均具有顯著下調(diào)作用(P0.05)。(6)0.2mg/m L荊芥揮發(fā)油和胡薄荷酮能抑制ATP致THP-1巨噬細胞中NLRP3和ASC的共定位效應(P0.01),降低ATP、Nigericin致THP-1巨噬細胞中ROS的表達(P0.05或P0.01),并能減少CPPD致THP-1巨噬細胞中Cathepsin B蛋白的表達(P0.01)。結(jié)論:荊芥揮發(fā)油體外對各種激活物(ATP、Nigericin、CPPD或CaCl_2)所誘導的THP-1巨噬細胞上清中IL-1β的高分泌具有抑制作用,表現(xiàn)出抗炎效應,作用機制可能與抑制NLRP3炎癥小體的激活有關(guān),胡薄荷酮作用與其相似,可認為是其有效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。研究結(jié)果進一步完善了解表藥荊芥揮發(fā)油部位抗炎作用的現(xiàn)代藥理研究,為其治療“表證”的臨床運用提供了藥理學依據(jù)。
【圖文】：

圖 1 荊芥揮發(fā)油的 GC-MS 總離子流圖表 1 荊芥揮發(fā)油 GC-MS 成分分析結(jié)果序號 化學成分名稱 分子式 分子量 相對含量（%1 薄荷酮（I-Menthone） C10H18O 154 42.012 胡薄荷酮（Pulegone） C10H16O 152 33.403 棕櫚酸（n-Hexadecoic acid） C16H32O2256 1.904 石竹烯（Caryophyllene） C15H24204 1.235 環(huán)己酮（Cyclohexanone） C6H10O 98 1.026 2-環(huán)己烯-1-酮（2-Cyclohexen-1-one） C6H8O 96 0.857 1-辛烯-3-醇（1-Octen-3-ol） C8H16O 128 0.828 8，9-去氫百里香酚（8,9-Dehydrothymol） C10H14O 150 0.789 薄荷醇（DL-menthol） C10H20O 156 0.6210 辣薄荷酮（(-)-trans-Isopiperitenol） C10H16O 152 0.5211 D－吉瑪烯（Germacrene D） C15H24204 0.4412 D-檸檬烯（D-Limonene） C10H16136 0.35131－辛烯－3－醇乙酸酯C10H18O2170 0.27

圖 3 THP-1 細胞經(jīng) 5ng/mL PMA 誘導 48h 后細胞形態(tài)（20×）注：箭頭所指為分化的典型的巨噬細胞2.3.2 NLRP3 炎癥小體激活條件考察將處于對數(shù)生長期的 THP-1 細胞接種于 96 孔板中（每孔 2×104個細胞），經(jīng)5ng/mL 的 PMA 誘導 48h 使其貼壁后，用 PBS 溶液清洗 3 次，除空白對照孔外其余各組再用 10μg/mL 的 LPS 刺激 3h，經(jīng) PBS 清洗 2 次后，分別加入不同濃度的激活物進行激活，各個激活物濃度及刺激時間如下：ATP（5mM）、Nigericin（5μM）刺激 1h，CPPD（40μg/mL）、CaCl2（5mM）刺激 6h。激活后收集細胞上清，采用 ELISA 法測定細胞上清中 IL-1β 的含量。結(jié)果表明，5mM 的 ATP、5μM 的 Nigericin 刺激 1h，40μg/mL 的 CPPD、5mM 的 CaCl2刺激 6h，均可顯著升高細胞上清液中 IL-1β 的含量（P<0.01）。見圖 4。
【學位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2633120