【摘要】：[目的]半夏瀉心湯作為經(jīng)典方劑,對于現(xiàn)代醫(yī)學消化道疾病中的作用廣泛。ICC作為近年來熱門的間質(zhì)細胞靶點被廣泛研究,發(fā)現(xiàn)其在多種消化道疾病有積極參與。本課題組前期已經(jīng)驗證了半夏瀉心湯在在體動物方面對ICC以及相關(guān)因子的影響。但是,胃腸道運動過程中涉及到的細胞和各種信號途徑龐雜,涉及到ICC的相關(guān)分子機制尚不明確。本實驗中研究從半夏瀉心湯對于ICC的凋亡相關(guān)蛋白出發(fā),探討半夏瀉心湯通過影響ICC的的凋亡來治療“心下痞”的可能作用機制。[方法](1)制備半夏瀉心湯含藥血清:分組飼養(yǎng)大鼠,灌胃分別獲取含藥血清以及含有去離子水的動物血清;(2)分離培養(yǎng)新生BALB/C小鼠的胃ICC,免疫熒光雙標c-kit蛋白、ANO1蛋白,鑒定細胞;(3)穩(wěn)定培養(yǎng)細胞后,隨機分為三組,空白組(含有胎牛血清)、含有去離子水的動物血清為正常對照組,半夏瀉心湯藥物血清組,用CCK8方法、流式細胞凋亡術(shù)檢測各組對ICC增殖、凋亡率的影響;(4)采用ELISA酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組細胞上清中eNOS內(nèi)皮一氧化氮合酶表達;生化法檢測一氧化氮NO含量;(5)采用western blot蛋白免疫印跡法檢測各組SCF蛋白、c-kit蛋白、Bcl-2蛋白、Bax蛋白、caspase3蛋白、NF-kB蛋白、PI3K蛋白表達情況;(7)采用實時熒光定量法,檢測半夏瀉心湯對各組SCFmRNA、c-kitmRNA、Bcl-2mRNA、Bax mRNA、caspase3mRNA、NF-kBmRNA、PI3KmRNA表達影響。[結(jié)果](1)細胞鑒定:采用免疫熒光顯微鏡鑒定得到了細胞的c-kit蛋白陽性表達和ANO1蛋白陽性表達。(2)不同組別間ICC活力對比:與空白組、正常組相比,半夏瀉心湯組對ICC的增殖無明顯影響(P0.05);24h的時候,半夏瀉心湯組的細胞活力達到頂值。(3)細胞凋亡率:與空白組(7.667±1.699)、正常組(6.3±2.317)相比,含藥組5%低濃度組(5.983±1.665)(P0.05)無明顯差異;含藥組10%中濃度組(4.733±1.397)顯著降低,(P0.05)差異有統(tǒng)計學意義;含藥組15%高濃度組(5.35±1.139)(P0.05)無明顯差異。(1)生化法(酶比色)和ELISA法檢測細胞上清中NO和eNOS表達:各組NO表達對比:與空白組NO(45.88±11.89),含藥組NO(25.81±6)表達降低,(P=0.0010.05)差異明顯,有統(tǒng)計學意義,與正常組NO(47.04±5.21)(P0.05)差異有統(tǒng)計學意義;空白組與正常組相比,(P0.05)差異無統(tǒng)計學意義。各組eNOS表達對比:與空白組eNOS(56.49±23.09)相比,含藥組eNOS(28.43±13.25)表達減少,(P=0.020.05)差異有統(tǒng)計學意義,與正常組eNOS(56.16±19)相比,含藥組eNOS表達減少,(P=0.020.05)差異有統(tǒng)計學意義;正常組與空白組相比(P0.05)差異無統(tǒng)計學意義。(2)Western blot檢測ICC凋亡相關(guān)蛋白表達:與空白組相比,正常組各蛋白表達P值均大于0.05,差異無統(tǒng)計學意義;含藥組c-kit蛋白表達(P=0.280.05)差異無統(tǒng)計學意義,含藥組NF-κB(P=0.0740.05)差異無統(tǒng)計學意義,其余各組蛋白表達均有明顯差異。與正常組相比,含藥組c-kit蛋白表達(P=0.2120.05)差異無統(tǒng)計學意義,含藥組NF-κB(P=0.0640.05)差異無統(tǒng)計學意義,其余各組蛋白與正常組相比均有明顯差異。(3)實時熒光定量檢測ICC凋亡相關(guān)基因表達:空白組設(shè)置為參照組,CT值設(shè)為1。含藥組c-kit(2.304±0.378)與正常組(1.711±0.382)相比,(P0.05)差異顯著,有統(tǒng)計學意義;Bcl-2(1.416±0.204)與正常組(0.819±0.257)相比,(P0.05)差異顯著,有統(tǒng)計學意義;含藥組SCF(1.253±0.372)與正常組(0.869±0.376)相比,(P0.05)無統(tǒng)計學意義;含藥組Bax(1.108±0.397)與正常組(1.428±0.111)相比,(P0.05)差異顯著,有統(tǒng)計學意義;含藥組caspase3(1.359±0.385)與正常組(1.921±0.243)相比,(P0.05)差異顯著,有統(tǒng)計學意義;含藥組PI3K(1.003±0.152)與正常組(1.626±0.292)相比,(P0.05)差異顯著,有統(tǒng)計學意義;含藥組NF-κκBp65(0.896±0.273)與正常組(1.419±0.339)相比,(P0.05)差異顯著,有統(tǒng)計學意義。[結(jié)論](1)半夏瀉心湯抑制ICC凋亡,24h,10%濃度的半夏瀉心湯全方的SD大鼠半夏瀉心湯含藥血清培養(yǎng)明顯有利于抑制ICC凋亡。(2)半夏瀉心湯對于ICC分泌eNOS、NO有明顯抑制作用。(3)半夏瀉心湯可以促進ICC SCF、Bcl-2蛋白的表達,減少ICC的caspase3、Bax、PI3K表達;上調(diào)ICC的c-kit、Bcl-2 基因表達,下調(diào)ICC的caspase3、NF-κ Bp65、PI3K、Bax基因表達。(4)綜上,半夏瀉心湯對ICC凋亡相關(guān)的蛋白和基因有一定影響,初步探討可能與SCF/C-kit信號通路和PI3K、NO信號通路協(xié)同作用有一定相關(guān)性,信號通路之間的具體協(xié)同機制需要進一步深入研究,半夏瀉心湯對胃腸道運動的調(diào)節(jié)可能與抑制ICC凋亡有密切相關(guān)性。
【圖文】：

ＮＯ邋ｒｅｃｐｔｏｒ圖２邋ＩＣＣ、平滑肌細胞和相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)的分布圖Ｍ逡逑ＣＣ的慢波活動與離子通道的關(guān)系逡逑細胞間進行信息傳遞除了依靠電活動以外，還需要依靠多種物質(zhì)，包括激素、神經(jīng)逡逑

逑細胞與細胞間開始有了連接，為避免細胞過度生長重疊影響觀察，加入ｌｍｌ的０．２５％的逡逑含有（ＥＤＴＡ）的胰酶消化，１０００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ離心傳代（圖１－１Ｄ）；第二周時，鏡下逡逑觀察到ＩＣＣ突起大量延長交叉相連形成類似于平滑肌的長條形，，初級分支下開始有次逡逑級分支，且成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但是細胞數(shù)目開始變少，平滑肌細胞數(shù)目繼續(xù)增多（圖１－１Ｅ）；逡逑細胞培養(yǎng)至三周左右時細胞體積明顯縮小，ＩＣＣ網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)萎縮，邊界不清，形態(tài)模糊。逡逑平滑肌樣細胞并未繼續(xù)增多（圖１－１Ｆ）逡逑■逡逑ＳＢ逡逑圖丨－丨不同時間段丨ＣＣ形態(tài)（倒置顯微鏡Ｘ２００）逡逑３．３細胞鑒定逡逑３．３．１原代ＩＣＣ鑒定逡逑３０逡逑
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2630839