【摘要】：目的結(jié)合課題組前期采用基因芯片篩選阿霉素誘導(dǎo)的慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis,CGN)大鼠模型和芪藤消濁顆粒干預(yù)后的CGN大鼠模型的基因表達(dá)譜的研究基礎(chǔ),本研究采用高通量測(cè)序(high through-put sequencing,HTS)技術(shù)檢測(cè)并比較CGN模型組、正常對(duì)照組和芪藤消濁顆粒干預(yù)后的大鼠腎組織中環(huán)狀RNA(circular RNA,circ RNA)的表達(dá)譜變化,探討CGN可能的發(fā)病機(jī)制及芪藤消濁顆粒的作用機(jī)理。方法雄性SD大鼠50只,隨機(jī)挑選10只作為正常組,其余大鼠分別于第1天和第14天尾靜脈注射阿霉素(adriamycin,ADR)。第1天注射阿霉素的劑量為4.0mg/kg,第14天注射阿霉素的劑量為3.5mg/kg,第21天將所有大鼠置于代謝籠中留取24小時(shí)尿液并檢測(cè)24小時(shí)尿蛋白總量。本研究中判斷模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為24小時(shí)尿蛋白總量50mg/kg。隨后我們隨機(jī)挑選造模成功的模型大鼠30只并隨機(jī)分為模型組、芪藤消濁顆粒組(10.8g/kg)和陽(yáng)性藥黃葵膠囊組(1.0g/kg),每組10只,芪藤消濁顆粒組和陽(yáng)性藥黃葵膠囊組分別灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物,其余組給予等量的生理鹽水灌胃,每天1次,共30天。于末次給藥后,再次將所有大鼠置于代謝籠中留取24小時(shí)尿液并檢測(cè)24小時(shí)尿蛋白總量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,通過(guò)稱(chēng)量各組大鼠的雙側(cè)腎臟重量除以相應(yīng)大鼠體重計(jì)算腎臟臟器指數(shù);蘇木精-伊紅染色(HE)染色和電鏡觀察各組大鼠腎組織的病理學(xué)改變;高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)組織中circ RNA的表達(dá)譜;具有顯著意義的差異的環(huán)狀RNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)為fold change(FC)2并且P0.05;基于mi Randa的專(zhuān)有mi RNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件(http://www.microrna.org)預(yù)測(cè)模型組和對(duì)照組之間所有差異表達(dá)的circ RNAs靶向的mi RNAs,再用mi RTar Base預(yù)測(cè)潛在的mi RNAs靶向的m RNAs,進(jìn)一步通過(guò)Cytoscape(http://cytoscape.github.io/)軟件構(gòu)建circ RNA-mi RNA-m RNA ce RNA網(wǎng)絡(luò);用clusterprofiler軟件對(duì)上面circ RNA-mi RNA-m RNA ce RNA網(wǎng)絡(luò)中的的mRNAs進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)和信號(hào)通路(Pathway)分析;隨機(jī)選擇4個(gè)顯著差異表達(dá)的circ RNAs,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)在所有的對(duì)照組、模型組和芪藤消濁顆粒組大鼠中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果1.高通量測(cè)序的檢測(cè)結(jié)果:在9組樣本中共檢測(cè)出5363個(gè)環(huán)狀RNA,經(jīng)過(guò)篩選標(biāo)準(zhǔn):FC2并且P0.05過(guò)濾得到對(duì)照組和模型組中差異表達(dá)的circ RNAs有31個(gè),其中模型組中上調(diào)的circ RNAs有14個(gè)、下調(diào)的circ RNAs有17個(gè);這些circ RNAs廣泛分布于所有染色體上,包括Y染色體;模型組和芪藤消濁顆粒組中顯著差異表達(dá)circ RNAs有21個(gè),將這21個(gè)circ RNAs與上面31個(gè)circ RNAs取交集得到由于復(fù)制阿霉素CGN模型而導(dǎo)致失調(diào)并被芪藤消濁顆粒逆轉(zhuǎn)的circ RNAs有4個(gè)。2.對(duì)于差異表達(dá)的circ RNAs的生物信息學(xué)分析結(jié)果:模型組與對(duì)照組之間顯著差異表達(dá)的31個(gè)circ RNA至少有4種潛在mi RNA的結(jié)合位點(diǎn),超過(guò)83%的circ RNAs至少擁有23種潛在的mi RNA結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步針對(duì)差異表達(dá)的circ RNAs的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示模型組和對(duì)照組中差異表達(dá)的circ RNAs潛在靶向的mi RNAs和m RNAs與CGN的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切;同樣地,被芪藤消濁顆粒逆轉(zhuǎn)的4個(gè)circ RNAs潛在靶向的mi RNAs和m RNAs也與CGN的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。3.差異表達(dá)的circ RNA的q RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果:應(yīng)用q RT-PCR在對(duì)照組和模型組中所有的大鼠上驗(yàn)證在模型組中上調(diào)的2個(gè)circ RNAs:rno-circ RNA-689、rno-circ-RNA-3217和在模型組中下調(diào)的2個(gè)circ RNAs:rno-circ RNA-1327、rno-circ-RNA-5001,均與測(cè)序結(jié)果一致。另外,用q RT-PCR在對(duì)照組、模型組和芪藤消濁顆粒組所有的大鼠中驗(yàn)證rno-circ RNA-213、rno-circ RNA-689rno-circ RNA-3217和rno-circ RNA-5001的表達(dá)情況,結(jié)果均與測(cè)序結(jié)果一致。結(jié)論1.circ RNAs在慢性腎小球腎炎發(fā)病過(guò)程中存在差異表達(dá);2.芪藤消濁顆粒對(duì)慢性腎小球腎炎有一定的治療作用,其作用機(jī)理可能與調(diào)節(jié)差異表達(dá)的circ RNAs有關(guān).
【圖文】：

圖 1 HE 染色觀察大鼠腎皮質(zhì)組織的病理學(xué)改變（ⅹ200）Fig 1. HE-staining observation of pathological changes in rat renal cortex（ⅹ200）注：A：對(duì)照組；B：模型組；C：QTXZG 組；D：黃葵膠囊組；a：間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；b：蛋白質(zhì)管形；c:系膜細(xì)胞增生。透射電鏡下，正常組腎小球系膜細(xì)胞無(wú)增生，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)清晰完整，呈杵樣并列排列于基底膜外側(cè)，基底膜結(jié)構(gòu)完整，厚度均勻；模型組腎小球系膜基質(zhì)增多，系膜區(qū)增寬， 足突節(jié)段性輕、中度融合，，系膜區(qū)可見(jiàn)云霧狀電子致密物質(zhì)沉積，芪藤消濁顆粒組腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)輕微增生，系膜區(qū)寬度與模型組相比明顯變窄，足突節(jié)段性輕度融合，少許云霧狀電子致密物沉積；黃葵膠囊組腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)輕微增生，足突節(jié)段性輕度融合（圖 2）。

23圖 2. 電鏡觀察大鼠腎皮質(zhì)組織的病理學(xué)改變（ⅹ3000）Fig 2. Electron microscopic observation of pathological changes in rat renal cortex（ⅹ3000）注：A：對(duì)照組；B：模型組；C：QTXZG 組；D：黃葵膠囊組；a：足突融合；b：系膜基質(zhì)增多
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2630737