【摘要】：目的:雷公藤紅素是中國傳統(tǒng)中藥雷公藤單體之一,在抗腫瘤領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景,本研究以體外培養(yǎng)的人骨肉瘤HOS細胞為研究對象,雷公藤紅素處理人骨肉瘤HOS細胞后,檢測雷公藤紅素能否誘導HOS細胞凋亡,并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體損傷的角度探討細胞信號轉(zhuǎn)導和蛋白分子表達水平,探討相關(guān)凋亡的機制及與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系和以PERK為干預靶點增強雷公藤紅素誘導骨肉瘤凋亡的有效性,通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平增強雷公藤紅素抗骨肉瘤效應(yīng)為雷公藤紅素應(yīng)用于臨床治療提供新的研究思路。方法:用不同濃度(0、1.5、2.5、3.5和4.5 μmol/L)的雷公藤紅素處理骨肉瘤HOS細胞24h后,采用CCK-8法檢測細胞活性,確定最佳實驗濃度。采用倒置相差顯微鏡觀察雷公藤紅素處理后HOS細胞形態(tài)的變化,經(jīng)Hoechst33258染色后在相差顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態(tài)學改變,用Annexin V-PI法檢測雷公藤紅素處理HOS細胞后細胞凋亡率的改變。采用流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度變化,采用蛋白質(zhì)印跡法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡相關(guān)蛋白分子表達水平,明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡相關(guān)通路是否參雷公藤紅素誘導的骨肉瘤HOS細胞凋亡。同時,采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導劑毒胡蘿卜素(thapsigargin,TG)處理骨肉瘤HOS細胞后,蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡相關(guān)蛋白表達水平,為雷公藤紅素誘導的骨肉瘤HOS細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激提供陽性對照。進一步采用蛋白質(zhì)印跡法檢測線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達水平變化,明確線粒體凋亡相關(guān)通路是否參雷公藤紅素誘導的骨肉瘤HOS細胞凋亡。采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑(tauroursodeoxycholate,TUDCA)抑制細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平,采用Annexin V-PI法檢測HOS細胞凋亡水平的變化,蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬和凋亡相關(guān)分子蛋白的變化,明確雷公藤紅素誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對HOS細胞凋亡的影響。最后,使用PERK磷酸化抑制劑(GSK2656157)下調(diào)PERK的磷酸化程度,抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中PERK相關(guān)通路活性,采用Annexin V-PI法檢測細胞凋亡水平,蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬和凋亡相關(guān)蛋白分子表達水平,明確抑制PERK相關(guān)通路活性是否可以促進雷公藤紅素誘導的骨肉瘤HOS細胞凋亡。結(jié)果:不同濃度的雷公藤紅素均可明顯抑制骨肉瘤HOS細胞活性,且其抑制效果呈濃度依賴性。雷公藤紅素可誘導骨肉瘤HOS細胞凋亡,同時激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡相關(guān)通路和線粒體凋亡相關(guān)通路,主要表現(xiàn)為經(jīng)雷公藤紅素處理后漂浮、紊亂HOS細胞增多,凋亡率明顯升高,細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、破碎,細胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡相關(guān)通路蛋白表達水平明顯升高,線粒體性凋亡相關(guān)通路蛋白表達水平也明顯升高。預處理TUDCA能抑制HOS細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,促進細胞凋亡,表現(xiàn)為使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑后,HOS細胞凋亡率明顯升高,細胞凋亡相關(guān)蛋白分子表達水平也顯著升高。PERK磷酸化抑制劑(GSK2656157)可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中PERK相關(guān)通路的激活,繼而抑制HOS細胞自噬,促進細胞凋亡,表現(xiàn)為使用PERK磷酸抑制劑預處理HOS細胞后,細胞內(nèi)磷酸化PERK蛋白表達明顯下調(diào),細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平明顯上調(diào),細胞凋亡率明顯升高。結(jié)論:雷公藤紅素可誘導人骨肉瘤HOS細胞凋亡,其作用機制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導細胞凋亡相關(guān)通路和線粒體凋亡相關(guān)通路有關(guān)。細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護HOS細胞的同時也抑制細胞凋亡。PERK通路的激活介導了細胞自噬的發(fā)生。下調(diào)PERK通路的表達,可抑制HOS細胞自噬的活性,促進細胞凋亡。
【圖文】：

２結(jié)果逡逑２．１雷公藤紅素可明顯降低骨肉瘤ＨＯＳ細胞的增殖活性逡逑ＣＣＫ－８法檢測結(jié)果（圖１）顯示，不同濃度（１．５、２．５、３．５和４．５ｐｍｏｌ／Ｌ）的逡逑雷公藤紅素能明顯抑制人骨肉瘤ＨＯＳ細胞的增殖活性（各濃度組與ＤＭＳＯ組相比逡逑的尸值都小于０．０５），并呈一定的濃度依賴性（各濃度之間兩兩相比的Ｐ值皆小逡逑于０．０５）邋；邋ＤＭＳＯ組未出現(xiàn)細胞增殖抑制現(xiàn)象。計算得知，雷公藤紅素處理ＨＯＳ逡逑細胞２４邋ｈ的ＩＣ５0為３．３邋ｐｍｏｌ／Ｌ。因此，選�。常板澹穑恚铮欤痰睦坠偌t素處理濃度用逡逑于后續(xù)實驗［９］。逡逑１．５，邐Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｇｒｏｕｐ逡逑－ｍ－邋ＤＭＳＯ逡逑＾邋．邐＿逡逑＾邋１．０邋彳邋邐＊邐邐邐■邐■逡逑Ｉ－逡逑０．０－Ｉ邐１邐１邐１邐１邐１逡逑０邐１邐２邐３邐４邐５逡逑Ｃｅｌ（ｐＭ）逡逑圖１邋ＣＣＫ－８法檢測不同濃度的雷公藤紅素處理２４邋ｈ對人骨肉瘤ＨＯＳ細胞增殖的抑制作用逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．１邋Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋（０，，１．５，２．５，３．５邋ａｎｄ邋４．５邋ｆｉｍｏｌ／Ｌ）邋ｏｆ逡逑ｃｅｌａｓｔｒｏｌ邋ｏｎ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｈｕｍａｎ邋ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ邋ＨＯＳ邋ｃｅｌｌｓ邋ｆｏｒ邋２４邋ｈ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ＣＣＫ－８逡逑ｍｅｔｈｏｄ．邋ＤＭＳＯ邋ｗａｓ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｔｒｅａｔ邋ＨＯＳ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｌｏｎｅ邋ａｓ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ．邋＊Ｐ＜０．０５

邐重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文邐逡逑組相比，３．０邋ｔｕｎｏｌ／Ｌ雷公藤紅素處理２４邋ｈ后人骨肉瘤ＨＯＳ細胞的凋亡率明顯升高，逡逑提示雷公藤紅素可以誘導ＨＯＳ細胞凋亡（ＰＣ０．０５，圖２Ｃ，２Ｄ）。逡逑Ａ邐Ｃｏｎｔｒｏｌ邐Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ（２４邋ｈ）邐Ｂ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邐Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ（２４邋ｈ）逡逑
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2630191